查理五世為天主教奉獻(xiàn)了全部忠誠乃至狂熱。他是宗教改革運(yùn)動(dòng)的激烈反對者，并企圖建立一個(gè)“世界天主教帝國”。1521年，查理五世以皇帝身份傳喚馬丁·路德參加沃爾姆斯宗教會(huì)議（許諾保證路德的人身安全）。他在這次會(huì)議上宣布路德及其追隨者為非法（1521年沃爾姆斯敕令）。
　　1524年有鑒于德國爆發(fā)農(nóng)民起義而新教諸侯組成了施馬爾卡爾登聯(lián)盟，查理五世決定把德意志事務(wù)交給弟弟斐迪南（即日后的斐迪南一世）全權(quán)辦理。
　　1545年特倫特公會(huì)議的召開宣告了歐洲天主教勢力反對宗教改革的浪潮的開始。查理五世決心懲罰德意志的新教王公。1546年查理五世與施馬爾卡爾登聯(lián)盟開戰(zhàn)。在戰(zhàn)爭的第一階段（1546年—1548年）他打敗了薩克森選侯約翰·腓特烈, 并將投降的黑森侯爵（慷慨的）腓力一世監(jiān)禁起來（1547年—1552年）。然而，他是先勝后敗。新的戰(zhàn)事于1552年爆發(fā)后，查理五世遭到一系列失利，遂與諸侯簽訂1555年奧格斯堡宗教和約。