1527年春，查理五世派遣一支軍隊，由波旁公爵率領(lǐng)，從米蘭出發(fā)開赴羅馬。5月，雙方軍隊在羅馬城下交戰(zhàn)，波旁公爵戰(zhàn)死。無人指揮的2萬多名德國軍隊和西班牙軍隊紛紛嘩變，他們擁進圣城，不分青紅皂白地燒殺搶劫，無數(shù)珍貴的文物圣品被洗劫一空。查理五世在羅馬城下的慘敗增強了弗朗西斯一世奪取勝利的信心。6月，他派大軍進入意大利，陸軍占領(lǐng)米蘭和帕維亞，艦隊迫使熱那亞倒戈屈服，接著，法將洛特列克率軍南下，遠征那不勒斯。在熱那亞和威尼斯艦隊的支援下，法軍于1528年冬占領(lǐng)王國大部地區(qū)，包圍了那不勒斯城。但就在勝利來臨之際，風云突變：熱那亞轉(zhuǎn)向敵人方面，法國失去了制海權(quán)；鼠疫在軍中流行，官兵大量死亡。弗朗西斯增兵無源，無法再戰(zhàn)，只好與查理五世議和。根據(jù)1529年在康布雷簽訂的和約，弗朗西斯一世被迫放棄對意大利的主權(quán)要求，但法國保留了勃艮第。接著，查理五世又同克里門七世達成協(xié)議：克里門七世答應把那不勒斯授予查理五世；查理五世則保證派帝國軍隊去推翻新近成立的佛羅倫薩共和國，使美第奇家族得以復辟。