科學(xué)研究的設(shè)計(jì)和方法中的科學(xué)性

科學(xué)研究的設(shè)計(jì)和方法中的科學(xué)性[關(guān)鍵詞] 科學(xué)研究 設(shè)計(jì) 方法

健康網(wǎng)訊:

 成軍, 中國(guó)人民解放軍第302醫(yī)院傳染病研究所基因治療研究中心、       全軍病毒性肝炎防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室  北京市  100039摘要    生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的研究發(fā)展很快，不斷有新的理論和技術(shù)出現(xiàn)，推動(dòng)著生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的不斷發(fā)展. 現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)和理論為肝臟病學(xué)的研究提供了前所未有的機(jī)遇. 由于發(fā)展不平衡，對(duì)于新理論和新技術(shù)的接受程度和推廣還有一段艱難的過(guò)程. 在這一過(guò)程中，不可避免地存在一些認(rèn)識(shí)上的誤差和偏差. 因此本文選取3個(gè)有代表性的例子，闡明科學(xué)研究的設(shè)計(jì)和方法中的科學(xué)性.0   引言    我作為幾家雜志的編委，經(jīng)常會(huì)審閱來(lái)自不同單位的稿件，在審閱過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了一些問(wèn)題. 本文的目的是提出一些問(wèn)題，供編者、讀者作為參考，共同提高我們科研設(shè)計(jì)的水平和學(xué)術(shù)論文的質(zhì)量. 關(guān)于正確理解現(xiàn)代分子生物學(xué)理論和技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中的應(yīng)用，有許多鮮明的例子，本文主要選取3個(gè)有代表性的例子，說(shuō)明在科研設(shè)計(jì)和學(xué)術(shù)論文鑒賞過(guò)程中常見(jiàn)的誤區(qū).1   研究基因轉(zhuǎn)錄水平主要考慮的是啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性    在審稿過(guò)程中，我接到一篇研究核苷類(lèi)似物拉米夫定(lamivudine)抑制乙型肝炎病毒(HBV)X基因的研究報(bào)道. 基本的研究方法和過(guò)程如下: 首先利用分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建HBV X基因的真核表達(dá)載體，如具有巨細(xì)胞病毒(CMV)早期即刻基因啟動(dòng)子的pcDNA3，然后用這一載體轉(zhuǎn)染肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞系HepG2，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，在細(xì)胞系的培養(yǎng)上清中加入拉米夫定，利用半定量的逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)，檢測(cè)HBV X基因的轉(zhuǎn)錄物水平，并進(jìn)行半定量分析，結(jié)果證明HBV X基因的轉(zhuǎn)錄物水平有顯著降低，結(jié)論是拉米夫定對(duì)于HBV X基因的轉(zhuǎn)錄具有顯著的抑制作用. 這一篇文章的設(shè)計(jì)存在嚴(yán)重的問(wèn)題，對(duì)于分子生物學(xué)的基本原理的理解有偏差，是不能發(fā)表的.      首先我們必須明白，基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)是在基因啟動(dòng)子指導(dǎo)下進(jìn)行的，基因轉(zhuǎn)錄水平的高低受到許多因素的影響，但是主要決定于啟動(dòng)子在這一系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)錄活性，而與啟動(dòng)子指導(dǎo)的目的基因的性質(zhì)沒(méi)有太多的關(guān)系[1-12]. 這樣的設(shè)計(jì)更多的是研究了拉米夫定對(duì)于CMV早期即刻基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用，而與HBV X基因的轉(zhuǎn)錄沒(méi)有關(guān)系. 如果本實(shí)驗(yàn)的目的基因換成別的什么基因，所得到的結(jié)果也同樣不能說(shuō)明目的基因的變化. 例如這一實(shí)驗(yàn)中我們將HBV X基因換成報(bào)告基因氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)，那么豈不是可以得出結(jié)論拉米夫定可以抑制氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)了嗎？顯然這是不合適的.      關(guān)于轉(zhuǎn)錄水平的研究，正確的研究方法設(shè)計(jì)應(yīng)該是特定基因的啟動(dòng)子序列與報(bào)告基因構(gòu)件成報(bào)告基因表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染合適細(xì)胞系，共同轉(zhuǎn)染其他的表達(dá)質(zhì)粒，或者在細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入某些藥物(如拉米夫定)，以研究基因表達(dá)或藥物對(duì)于該基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響[13-15]. 要研究什么基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，即選擇該基因的啟動(dòng)子基因序列，而不是選擇其編碼基因序列. 目前報(bào)告基因表達(dá)載體的構(gòu)建與細(xì)胞轉(zhuǎn)染模型的建立是研究基因表達(dá)調(diào)控非常常用和成熟的研究技術(shù)和策略，常用的報(bào)告基因包括CAT、b-半乳糖苷酶(b-gal，b-galactosidase)、螢蟲(chóng)素酶(Luc，luciferase)、和綠色熒光蛋白(GFP，green fluorescence protein)等. 報(bào)告基因CAT的檢測(cè)有酶聯(lián)免疫黏附法(ELISA)、同位素分析法，b-gal的檢測(cè)有ELISA法和免疫組織化學(xué)染色法，Luc的表達(dá)可用化學(xué)發(fā)光法，而GFP是惟一可以在活細(xì)胞中進(jìn)行觀察的報(bào)告基因類(lèi)型. 以上報(bào)告基因類(lèi)型可以根據(jù)具體的研究條件和研究的目的進(jìn)行選擇. 但是，無(wú)論采用的是何種類(lèi)型的報(bào)告基因，其表達(dá)水平并不代表報(bào)告基因的調(diào)控，而是代表了報(bào)告基因上游的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性水平. 利用報(bào)告基因表達(dá)載體的研究技術(shù)，具有很多的優(yōu)點(diǎn)，其一可以避開(kāi)內(nèi)源和外源基因表達(dá)水平的影響. 例如，研究一種基因的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)而進(jìn)行報(bào)告基因表達(dá)載體的構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染，如果表達(dá)產(chǎn)物是基因編碼產(chǎn)物本身，就難以區(qū)別內(nèi)源性基因的編碼水平或者是外源轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)水平. 采用報(bào)告基因就可以解決這一問(wèn)題，因?yàn)椴捎玫膱?bào)告基因類(lèi)型是細(xì)胞本身不表達(dá)的產(chǎn)物，因此，對(duì)于報(bào)告基因編碼產(chǎn)物的檢測(cè)水平可以精確地反映基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，不會(huì)受到內(nèi)源性基因表達(dá)產(chǎn)物水平的影響. 第二，如果研究不同基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，采取本身基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)方法，必須建立各種基因表達(dá)產(chǎn)的檢測(cè)方法，有些基因的表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)技術(shù)還不具備，或者很難建立，但是如果采用報(bào)告基因的研究策略就很容易解決這一問(wèn)題，只要建立穩(wěn)定的報(bào)告基因表達(dá)的檢測(cè)技術(shù)就可以應(yīng)用不同基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的檢測(cè)和研究. 這也正是基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)研究策略中非常成熟和公認(rèn)的做法[16-18].2   肝炎病毒準(zhǔn)種特點(diǎn)是一個(gè)不能忽視的問(wèn)題    乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒(HCV)存在狀態(tài)時(shí)準(zhǔn)種(quasispecies)狀態(tài)，這是一個(gè)不能忽略的問(wèn)題[19-31]. 在研究抗病毒治療前后的病毒的基因序列改變的研究中尤其要注意病毒基因準(zhǔn)種的特點(diǎn). 例如，一篇論文研究慢性乙型肝炎的抗病毒治療前后的病毒基因序列的改變，治療前留取患者的血清，抗病毒治療后再一次留取血清，由兩份血清提取HBV DNA，應(yīng)用聚合酶聯(lián)反應(yīng)(PCR)技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增的HBV DNA片段進(jìn)行克隆化，各挑取1個(gè)克隆進(jìn)行序列分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2個(gè)序列存在差別，因此就判定抗病毒治療前后病毒的基因序列發(fā)生了改變，而且認(rèn)為這種改變與抗病毒治療的效應(yīng)有關(guān). 如果慢性乙型肝炎患者抗病毒治療前后的HBV基因序列始終各自都是均一的病毒基因序列，或許這種研究方法是可行的，但是，事實(shí)上HBV基因序列有準(zhǔn)種特點(diǎn)，就是說(shuō)慢性乙型肝炎患者血清中的病毒，其基因序列，不同的病毒株之間十分相似，但又不同，這種相似性達(dá)到95%以上，差別占總核苷酸數(shù)的5%以下，這種差別較小，還不足以分成不同的血清型，也不足以分成不同的基因型，但這種差別又是客觀存在的. 病毒株之間的差別是一個(gè)較為普遍的現(xiàn)象，甚至在患者的血清中很難找到2株序列完全一致的病毒. 因此，我們對(duì)于HBV在患者血清中的存在狀態(tài)，應(yīng)該是把HBV看成是由不同的基因序列的HBV組成的一個(gè)病毒群，而且隨著病毒自身復(fù)制過(guò)程的變化，以及機(jī)體的免疫力和抗病毒藥物應(yīng)用的情況，各種病毒在病毒中所占的比例在時(shí)時(shí)刻刻的變動(dòng)之中[32-35]. 因此，準(zhǔn)種概念之所以十分重要，就是改變了以往人們對(duì)于HBV存在狀態(tài)的看法，換了一種角度來(lái)看HBV的存在狀態(tài)，更為客觀和準(zhǔn)確. 利用準(zhǔn)種的觀點(diǎn)來(lái)看上述研究結(jié)果，就不難看出這種科研設(shè)計(jì)的局限性. 如果慢性乙型肝炎患者血清中HBV的拷貝數(shù)在1011拷貝/mL，而且各株病毒間的序列都是不同的，那么在治療前隨機(jī)擴(kuò)增、克隆、測(cè)序一個(gè)克隆，僅僅代表的是該病毒株而已，與其他病毒無(wú)關(guān)，沒(méi)有多少普遍的意義. 如果治療后，也是隨機(jī)挑取一個(gè)病毒基因序列進(jìn)行測(cè)定，也是同樣的道理. 但是，治療前后研究同一個(gè)病毒的可能性只有1/108，換句話說(shuō)這是不可能的. 因此，在治療前后，根本就是對(duì)于2株肯定不一樣的病毒基因序列進(jìn)行比較，這樣的結(jié)果與治療的效應(yīng)又有何干？因此，不能對(duì)于治療前后各1個(gè)或少數(shù)的病毒基因序列進(jìn)行測(cè)定來(lái)研究抗病毒治療前后病毒基因序列的改變，這種差別根本就不可能與治療的效應(yīng)有關(guān).    類(lèi)似的例子還有很多. 有些有心人對(duì)于血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移(ALT)正常的HBV無(wú)癥狀攜帶者(ASC)進(jìn)行研究，觀察病情變化過(guò)程中病毒基因序列的改變. 也是在ALT治療前獲取一個(gè)HBV基因克隆進(jìn)行序列測(cè)定，在治療后又獲取一個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，并且將ALT正常和ALT升高2個(gè)時(shí)間點(diǎn)的HBV基因序列進(jìn)行比較，并且將這種差別，解釋為HBV感染者從ALT正常狀態(tài)到ALT升高狀態(tài)轉(zhuǎn)變過(guò)程中的HBV基因序列的變化及其規(guī)律，殊不知2次獲得HBV病毒株根本就是不同的病毒，序列本來(lái)就不同，這樣的比較不但沒(méi)有意義，還會(huì)誤導(dǎo)HBV基因序列變化與病情變化之間相關(guān)性的研究. 如果將HBV基因準(zhǔn)種特點(diǎn)考慮進(jìn)去，就不難理解這樣的科研設(shè)計(jì)的局限性，就可以避免類(lèi)似的錯(cuò)誤或不足之處. 因此，關(guān)于HBV準(zhǔn)種研究的結(jié)果，盡管這一概念十分淺顯，容易理解，但是對(duì)于我們認(rèn)識(shí)HBV的存在狀態(tài)，進(jìn)行合理的科研設(shè)計(jì)，提高學(xué)術(shù)論文的鑒賞水平，都具有十分重要的意義. 同樣的道理，關(guān)于HCV和人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的類(lèi)似研究，也必須將病毒基因的準(zhǔn)種特點(diǎn)考慮進(jìn)去，事實(shí)上，關(guān)于HBV準(zhǔn)種特點(diǎn)的研究就是采用了在HCV、HIV-1的研究中所采用的準(zhǔn)種概念.      研究病情變化前后，或者是研究治療前后病毒基因序列的改變，應(yīng)該將準(zhǔn)種特點(diǎn)考慮進(jìn)去，因此不能通過(guò)單個(gè)或少數(shù)的幾個(gè)克隆的序列分析進(jìn)行判斷[36-38]. 正確的做法是對(duì)于病毒的準(zhǔn)種種群進(jìn)行研究，從優(yōu)勢(shì)種群的漂變(shift)規(guī)律來(lái)解釋病毒基因序列的改變與病情變化和治療療效之間的關(guān)系. 由于病毒的準(zhǔn)種特點(diǎn)，由于病毒的基因序列的異質(zhì)性(heterogeneity)廣泛存在，應(yīng)用目前少數(shù)克隆的序列分析技術(shù)是不可能解決的. 近年來(lái)基因芯片(DNA chips)這類(lèi)高通量分析技術(shù)的出現(xiàn)為研究這一課題提供了前所未有的機(jī)遇. 可以通過(guò)基因芯片的高通量研究，對(duì)于HBV基因準(zhǔn)種的特點(diǎn)進(jìn)行研究，闡明HBV基因的變化與臨床病情之間的相互關(guān)系、與抗病毒治療療效之間的相互關(guān)系.3   結(jié)合蛋白和受體的區(qū)別    利用配體蛋白分子進(jìn)行篩選，一方面可能會(huì)得到受體蛋白分子，另一方面也會(huì)得到蛋白結(jié)合蛋白. 如果只是發(fā)現(xiàn)一種配體蛋白結(jié)合的蛋白，還不足以肯定這種蛋白就是配體蛋白的受體蛋白分子，還需要有另外的足夠的研究證據(jù)，否則就會(huì)不完整，就會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)論.      研究蛋白蛋白之間相互結(jié)合的技術(shù)相當(dāng)多[39-51]. 研究細(xì)胞內(nèi)蛋白與蛋白質(zhì)間的結(jié)合與相互作用的技術(shù)，主要有哺乳動(dòng)物細(xì)胞雙雜交、活細(xì)胞的激光共聚焦顯微技術(shù)、酵母雙雜交技術(shù)等; 研究體外蛋白與蛋白之間相互作用的技術(shù)包括體外免疫共沉淀技術(shù)、放射性配體分析技術(shù)、拖拉(pull down)技術(shù)等[52-59]. 作為受體蛋白，必須具備與配體分子之間的結(jié)合，還必須具備跨膜的分布特征，與配體分子結(jié)合以后介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程. 配體分子與受體分子之間存在結(jié)合的現(xiàn)象，但是同時(shí)也會(huì)存在與其他蛋白結(jié)合的現(xiàn)象. 因此，僅僅只有與配體分子結(jié)合的能力還不夠，還必須闡明配體結(jié)合蛋白的分子結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，才能決定配體蛋白結(jié)合的蛋白分子究竟是否是受體分子. 如果明白這一點(diǎn)，就不會(huì)在僅僅證明有配體分子結(jié)合活性的情況下，就匆匆斷定這就是配體分子的受體分子. 這樣的研究結(jié)果，必須具備重組的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，否則僅僅靠蛋白之間的這種結(jié)合就判定是配體的受體分子就顯得證據(jù)不足，可能會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)論.      我們利用酵母雙雜交技術(shù)對(duì)于各種肝炎病毒的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白的結(jié)合蛋白進(jìn)行了系統(tǒng)的篩選，從理論上來(lái)講，如果“誘餌”質(zhì)粒表達(dá)的是肝炎病毒的包膜蛋白，那么就有可能篩選得到肝炎病毒的特異性受體分子，因?yàn)楹Y選的惟一要求是在酵母細(xì)胞中存在蛋白與蛋白之間的相互結(jié)合[60-66]. 但是，我們所篩選得到都是結(jié)合蛋白，都不是受體蛋白，可見(jiàn)結(jié)合蛋白與受體蛋白之間的差別.      研究一種配體分子蛋白的受體的研究策略，可以參考發(fā)現(xiàn)HIV-1第二受體分子的研究策略. 首先對(duì)于配體分子的細(xì)胞系通過(guò)流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)進(jìn)行分選、富集，從這樣的細(xì)胞系中分離純化總mRNA，可以很好地保證受體蛋白編碼基因的mRNA的豐度. 然后應(yīng)用這樣的mRNA逆轉(zhuǎn)錄后建立真核細(xì)胞表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染不表達(dá)配體蛋白分子的細(xì)胞系，然后利用配體分子與轉(zhuǎn)染細(xì)胞系結(jié)合的磁珠細(xì)胞分離方法，富集配體分子結(jié)合的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，從中提取質(zhì)粒DNA，以大腸桿菌擴(kuò)增質(zhì)粒，重復(fù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染，配體分子結(jié)合細(xì)胞的篩選等步驟，最終獲得配體分子結(jié)合的受體分子結(jié)合蛋白編碼基因. 無(wú)論采用什么樣的篩選技術(shù)和流程，最終的判斷篩選分子是否是受體分子，在沒(méi)有確定其分子結(jié)構(gòu)及功能之前，任何草率的結(jié)論都是一種誤導(dǎo)，應(yīng)該特別小心[67-69].      現(xiàn)代分子生物學(xué)的理論和技術(shù)，極大地推動(dòng)了現(xiàn)代肝臟病學(xué)的研究和進(jìn)展. 同時(shí)也在不斷地修正著我們對(duì)于肝臟病學(xué)的概念和理論. 在這一探索過(guò)程中，不可避免地存在著一些偏差，甚至是錯(cuò)誤[70-72]. 我們要勇于提出這些不足或者是錯(cuò)誤之處，只要我們認(rèn)識(shí)到了錯(cuò)誤或不足之處之所在，我們的認(rèn)識(shí)就會(huì)提高一步，我們的學(xué)科建設(shè)才會(huì)更快進(jìn)步.參考文獻(xiàn)1    成軍.丙型肝炎病毒致病的分子生物學(xué)機(jī)制. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志  2003;28:23-272    成軍. 新基因結(jié)構(gòu)與功能研究的策略. 世界華人消化雜志  2003;11:373-3773    成軍.病毒性肝炎發(fā)病機(jī)制中的反式調(diào)節(jié)機(jī)制. 世界華人消化雜志  2003;11:888-8964    成軍, 董菁, 洪源, 鐘彥偉, 劉妍, 王剛, 王琳. 乙型肝炎病毒中國(guó)流行株全基因的克隆與序列分析. 世界華人消化   雜志  2003;11:1083-10905    成軍, 董菁.乙型肝炎病毒基因組結(jié)構(gòu)與功能復(fù)雜性的新認(rèn)識(shí). 世界華人消化雜志  2003;11:1073-10806    成軍.病毒性肝炎發(fā)病機(jī)制相關(guān)基因克隆化的研究策略. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志  2003;28:757-7617    成軍.堅(jiān)持相對(duì)穩(wěn)定的科研方向是關(guān)鍵. 世界華人消化雜志  2003;11:1857-18618    成軍. 肝炎病毒與肝細(xì)胞相互作用的分子生物學(xué)機(jī)制研究策略. 中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志  2003;14:321-3239    韓萍, 劉妍, 成軍, 王剛, 陸蔭英, 李克, 李莉. 截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白上調(diào)c-myc基因表達(dá)的研究. 世界華人   消化雜志  2002;10:141-14410  王建軍, 劉妍, 成軍, 楊倩, 楊艷杰. 丙型肝炎病毒核心蛋白上調(diào)NIP3基因表達(dá)研究. 世界華人消化雜志  2003;11:951-95411  王建軍, 劉妍, 成軍, 楊倩, 楊艷杰. 丙型肝炎病毒核心蛋白上調(diào)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白WEE1基因表達(dá)研究. 世界華人消化   雜志 2003;11:947-95012  楊倩, 劉妍, 成軍, 王建軍, 楊艷杰, 張樹(shù)林. 丙型肝炎病毒核心蛋白上調(diào)層粘蛋白B1鏈基因啟動(dòng)子表達(dá)活性的研究. 世界   華人消化雜志  2003;11:955-95813  楊倩, 劉妍, 成軍, 李克, 王建軍, 洪源, 張樹(shù)林. 丙型肝炎病毒核心蛋白結(jié)合蛋白6上調(diào)新生多肽相關(guān)復(fù)合物a多肽基因的   表達(dá). 世界華人消化雜志  2003;11:959-96214  張忠東, 成軍, 鐘彥偉, 楊倩, 王業(yè)東, 董菁, 楊艷杰, 張樹(shù)林. 羧肽酶N調(diào)節(jié)乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子表達(dá)活性的研究. 世界   華人消化雜志  2003;11:1131-113415  王建軍, 劉妍, 成軍, 楊倩, 紀(jì)冬, 黨曉燕, 王春花. 表達(dá)譜基因芯片技術(shù)研究膦甲酸鈉上調(diào)細(xì)胞凋亡蛋白酶激活因子-1基因   的表達(dá). 中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志  2003;14:351-35416  洪源, 楊倩, 成軍, 劉妍, 王建軍. 丙型肝炎病毒NS5A蛋白上調(diào)NS3TP6基因啟動(dòng)子表達(dá)活性的研究. 世界華人消化   雜志  2004;12:813-81617  王建軍, 李寶偉, 成軍, 劉妍, 徐志強(qiáng), 楊倩, 紀(jì)冬, 黨曉燕, 王春花. 表達(dá)譜基因芯片技術(shù)研究甘草甜素上調(diào)白介素-18基   因的表達(dá). 世界華人消化雜志  2004;12:855-85818  成軍. 乙型肝炎病毒準(zhǔn)種研究的意義. 中華傳染病雜志  2001;19:197-19819  董菁, 成軍, 王勤環(huán), 劉友昭, 王剛, 施雙雙, 夏小兵, 邵清, 斯崇文. 慢性乙型肝炎患者體內(nèi)乙型肝炎病毒準(zhǔn)種特點(diǎn)的初   步研究. 中華內(nèi)科雜志  2000;39:838-83920  董菁, 成軍, 王勤環(huán), 施雙雙, 洪源, 皇甫競(jìng)坤, 王剛, 李莉, 斯崇文. 乙型肝炎病毒逆轉(zhuǎn)錄酶基因序列準(zhǔn)種與變異特點(diǎn)的   研究. 病毒學(xué)報(bào)  2001;17:270-27221  董菁, 成軍, 王勤環(huán), 施雙雙, 洪源, 皇甫競(jìng)坤, 王剛, 李莉, 斯崇文. 乙型肝炎病毒逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)基因序列準(zhǔn)種與變異研究. 解放   軍醫(yī)學(xué)雜志  2001;26:823-82522  皇甫竟坤, 董菁, 鄧紅, 成軍, 施雙雙, 洪源, 任喜民, 李莉. 乙型肝炎病毒核心基因啟動(dòng)子序列突變及準(zhǔn)種. 世界華人消化   雜志 2001;9:1323-132523  董菁, 成軍, 王勤環(huán), 皇甫競(jìng)坤, 施雙雙, 張國(guó)慶, 洪源, 李莉, 斯崇文. 乙型肝炎病毒DNA序列異質(zhì)性及準(zhǔn)種特點(diǎn)的研究. 中華   醫(yī)學(xué)雜志  2002;82:81-8524  董菁, 成軍, 王勤環(huán), 施雙雙, 皇甫競(jìng)坤, 王剛, 洪源, 李莉, 斯崇文. 乙型肝炎病毒前C/C基因準(zhǔn)種與變異特點(diǎn)的研究. 解放   軍醫(yī)學(xué)雜志  2002;27:122-12325  董菁, 成軍, 王勤環(huán), 王剛, 施雙雙, 劉妍, 夏小兵, 李莉, 張國(guó)慶, 斯崇文. 乙型肝炎病毒C基因啟動(dòng)子區(qū)準(zhǔn)種與變異特點(diǎn)的   研究. 中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志  2002;16:264-26626  董菁, 施雙雙, 皇甫競(jìng)坤, 成軍, 王勤環(huán), 李莉, 斯崇文. 乙型肝炎病毒X基因準(zhǔn)種特點(diǎn)的研究. 中國(guó)病毒學(xué)  2002;17:22-2627  成軍. 乙型肝炎病毒基因異質(zhì)性及準(zhǔn)種特點(diǎn)研究的臨床意義. 解放軍醫(yī)學(xué)雜  2002;27:112-11528  董菁, 李進(jìn), 施雙雙, 皇甫競(jìng)坤, 成軍, 王勤環(huán), 洪源, 王業(yè)東, 李莉, 斯崇文. 乙型肝炎病毒基因組準(zhǔn)種與變異特點(diǎn)的研究.     解放軍醫(yī)學(xué)雜志  2002;27:116-11829  董菁, 成軍, 皇甫競(jìng)坤, 洪源, 王剛, 陳國(guó)鳳, 李莉, 張玲霞, 陳菊梅. 乙型肝炎病毒序列個(gè)體化變異的初步觀察. 解放軍醫(yī)學(xué)   雜志 2002;27:119-12130  劉妍, 董菁, 皇甫競(jìng)坤, 成軍, 王剛, 王琳, 李莉. 乙型肝炎病毒X基因異質(zhì)性及對(duì)其反式激活功能的影響. 解放軍醫(yī)學(xué)   雜志  2002;27:125-12731  劉妍, 董菁, 皇甫競(jìng)坤, 成軍, 韓萍, 牟勁松, 李克, 鐘彥偉. 乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)基因異質(zhì)性及對(duì)其轉(zhuǎn)錄活性的影響.     解放軍醫(yī)學(xué)雜志  2002;27:128-13032  成軍, 董菁, 劉妍, 李莉, 斯崇文, 王勤環(huán), 張玲霞, 陳菊梅.乙型肝炎病毒準(zhǔn)種研究的臨床意義. 世界華人消化   雜志  2002;10:209-21133  董菁, 施雙雙, 皇甫競(jìng)坤, 成軍, 王勤環(huán), 李莉, 斯崇文. 乙型肝炎病毒前C/C基因準(zhǔn)種與變異特點(diǎn)的研究. 中華微生物學(xué)與   免疫學(xué)雜志  2002;22:2734  董菁, 成軍, 王勤環(huán), 劉友昭, 王剛, 施雙雙, 夏小兵, 邵清, 斯崇文. 慢性乙型肝炎患者體內(nèi)乙型肝炎病毒準(zhǔn)種特點(diǎn)的初步   研究. 臨床肝膽病雜志  2002;18:17-1935  成軍, 董菁, 劉妍, 王琳, 鐘彥偉, 王剛. 準(zhǔn)種是乙型肝炎病毒存在的基本方式. 世界華人消化雜志  2003;11:1238-124036  成軍. 從乙型肝炎病毒準(zhǔn)種特點(diǎn)看抗病毒治療的艱巨性. 新醫(yī)學(xué) 2004;35:(待發(fā)表)37  Dong J, Cheng J, Wang QH, Liu Y, Wang G, Shi SS, Xia XB, Shao Q, Si CW. The preliminary study on hepatitis B virus       (HBV) quasispecies in patients with chronic HBV infection. Chin J Infect Dis  2001;19:199-20338  Deng H, Dong J, Cheng J, Huangfu JK, Shi SS, Hong Y, Ren XM, Li L. Quasispecies groups in the core promoter region       of hepatitis B virus. Hepatobiliary Pancreatic Dis Int  2002;1:392-39639  李克, 王琳, 成軍, 張玲霞, 段惠娟, 陸蔭英, 楊繼珍, 劉妍, 洪源, 夏小兵, 王剛, 董菁, 李莉, 鐘彥偉, 陳菊梅. 酵母雙雜交   技術(shù)篩選克隆HCV核心蛋白結(jié)合蛋白基因1. 世界華人消化雜志  2001;9:1379-138340  李克, 王琳, 成軍, 陸蔭英, 張玲霞, 李莉, 劉妍, 段惠娟. 丙型肝炎病毒NS2基因酵母雙雜交“餌”載體構(gòu)建及表達(dá). 世界華人   消化雜志  2002;10:129-13241  王琳, 李克, 成軍, 陸蔭英, 王剛, 劉妍, 鐘彥偉, 段惠娟, 洪源. 篩選與克隆肝再生增強(qiáng)因子結(jié)合蛋白的基因. 世界華人消   化雜志  2002;10:161-16442  李克, 王琳, 成軍, 張玲霞, 段惠娟, 陸蔭英, 楊繼珍, 劉妍, 洪源. 酵母雙雜交技術(shù)篩選克隆丙型肝炎病毒NS3蛋白結(jié)合蛋白.     解放軍醫(yī)學(xué)雜志  2003;28:31-3343  王琳, 李克, 成軍, 陸蔭英, 張健, 陳天艷, 洪源, 劉妍, 王剛, 鐘彥偉. 酵母雙雜交技術(shù)篩選Hcbp6結(jié)合的肝細(xì)胞蛋白編碼   基因. 世界華人消化雜志  2003;11:385-38844  陳天艷, 成軍, 張樹(shù)林. 酵母雙雜交系統(tǒng)的原理及應(yīng)用. 世界華人消化雜志  2003;11:451-45545  陸蔭英, 王琳, 成軍, 李克, 劉妍, 張玲霞. 酵母雙雜交技術(shù)篩選HBcAg肝細(xì)胞結(jié)合蛋白基因. 世界華人消化   雜志  2003;11:426-42946  陸蔭英, 邵清, 成軍, 陳天艷, 王琳, 梁耀東, 劉妍, 張健, 李克, 張玲霞. 酵母雙雜交技術(shù)篩選鑒定乙型肝炎病毒e抗原結(jié)合   蛋白E-19的研究. 世界華人消化雜志  2003;11:1118-112147  陸蔭英, 陳天艷, 成軍, 邵清, 梁耀東, 王琳, 劉妍, 張健, 李克, 張玲霞. 酵母雙雜交技術(shù)篩選鑒定乙型肝炎病毒核心蛋白結(jié)   合蛋白新基因C-12的研究. 世界華人消化雜志  2003;11:1122-112548  張健, 成軍, 王琳, 邵清, 陸蔭英, 梁耀東, 陳天艷, 洪源. 丙型肝炎病毒E2蛋白結(jié)合蛋白的酵母雙雜交篩選研究. 解放軍醫(yī)   學(xué)雜志 2003;28:765-77749  張健, 成軍, 王琳, 邵清, 陸蔭英, 梁耀東, 陳天艷, 洪源. 丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白5B結(jié)合蛋白的酵母雙雜交篩選研究. 解放   軍醫(yī)學(xué)雜志  2003;28:768-77050  王琳, 李克, 成軍, 張鍵, 邵清, 梁耀東, 陳天艷, 劉妍, 鐘彥偉, 洪源. 丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白5A結(jié)合蛋白37基因的克隆   化研究. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志  2003;28:774-77651  成軍. 病毒性肝炎發(fā)病機(jī)制的分子生物學(xué)研究新探討. 傳染病信息  2003;16:6-852  成軍, 李克, 王琳, 陸蔭英, 劉妍, 王剛, 張玲霞. 豬丙型肝炎病毒核心蛋白結(jié)合蛋白6同源基因的克隆化研究. 生物學(xué)   雜志  2003;20:10-13, 3353  梁耀東, 成軍, 李強(qiáng), 王琳, 陸蔭英, 吳君, 程明亮. 酵母雙雜交技術(shù)篩選乙型肝炎病毒X蛋白結(jié)合蛋白基因. 世界華人消化   雜志 2003;11:1866-186954  梁耀東, 陸蔭英, 成軍, 李強(qiáng), 王琳, 吳君, 程明亮. 酵母雙雜交技術(shù)篩選肝細(xì)胞中與乙型肝炎病毒核心蛋白結(jié)合蛋白C-12相   互作用蛋白的研究. 世界華人消化雜志  2003;11:1862-186555  邵清, 成軍, 白雪帆, 王琳, 張健, 梁耀東, 劉敏, 李強(qiáng). 酵母雙雜交技術(shù)篩選白細(xì)胞HCV NS3蛋白結(jié)合蛋白基因. 世界華人   消化雜志  2003;11:1897-190056  王琳, 李克, 成軍, 張健, 邵清, 梁耀東, 劉敏. 應(yīng)用淋巴細(xì)胞表達(dá)型cDNA文庫(kù)的酵母雙雜交技術(shù)篩選丙型肝炎病毒非結(jié)   構(gòu)蛋白5A的結(jié)合蛋白. 中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志  2003;14:345-34857  陸蔭英, 李克, 王琳, 劉妍, 成軍, 李莉, 張玲霞. 酵母雙雜交技術(shù)篩選乙型肝炎病毒X蛋白結(jié)合蛋白基因. 中華傳染   病雜志 2004;22:47-4958  陸蔭英, 劉妍, 李克, 成軍, 王琳. 乙型及丙型肝炎受體的研究. 世界華人消化雜志  2002;10:211-21358  陸蔭英, 陳天艷, 成軍, 梁耀東, 王琳, 劉妍, 張健, 邵清, 李克, 張玲霞. 乙型肝炎病毒X蛋白與去唾液酸糖蛋白受體2突變體   相互作用的研究. 世界華人消化雜志  2003;11:1126-113060  李克, 王琳, 成軍, 陸蔭英, 洪源, 劉妍, 張玲霞.丙型肝炎病毒蛋白結(jié)合蛋白. 世界華人消化雜志  2002;10:215-21761  李克, 王琳, 成軍, 陸蔭英, 洪源, 劉妍, 張玲霞. 乙型肝炎病毒蛋白結(jié)合蛋白的研究. 世界華人消化雜志  2002;10:213-21562  董菁, 施雙雙, 王業(yè)東, 皇甫競(jìng)坤, 洪源, 李莉, 張玲霞, 成軍. cDNA文庫(kù)噬菌體展示法的建立及乙型肝炎病毒前S1蛋白結(jié)   合蛋白篩檢. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志  2002;27:321-32263  李克, 王琳, 成軍, 張玲霞, 段惠娟, 陸蔭英, 楊繼珍, 劉妍, 邵得志, 夏小兵, 王剛, 董菁, 李莉, 鐘彥偉, 洪源, 陳菊梅. 篩選   與克隆丙型肝炎病毒核心蛋白結(jié)合蛋白6基因. 中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志  2002;16:351-35464  王琳, 李克, 成軍, 陸蔭英, 張健, 劉妍, 王剛, 洪源, 王賀, 芮莉莉. 篩選與克隆丙型肝炎病毒NS5A蛋白結(jié)合蛋白基因. 解放   軍醫(yī)學(xué)雜志  2003;28:50-5265  陸蔭英, 李克, 王琳, 劉妍, 王業(yè)東, 成軍, 張玲霞. 乙型肝炎病毒前-S2蛋白結(jié)合蛋白的篩選. 中華肝臟病雜志 2003;11:8-1066  成軍, 李克, 陸蔭英, 王琳, 劉妍. 丙型肝炎病毒核心蛋白結(jié)合蛋白6基因和蛋白的生物信息學(xué)分析. 世界華人消化   雜志  2003;11:378-38467  梁耀東, 成軍, 陸蔭英, 吳君, 程明亮.乙型肝炎病毒核心蛋白結(jié)合蛋白的研究. 世界華人消化雜志  2003;11:1242-124568  陸蔭英, 陳天艷, 成軍, 梁耀東, 王琳, 劉妍, 李克, 張健, 邵清, 張玲霞. 乙型肝炎病毒前-S2蛋白結(jié)合蛋白基因S2-29的克   隆化研究. 世界華人消化雜志  2003;11:1114-111769  王琳, 李克, 成軍, 張健, 邵清. 乙型肝炎病毒X蛋白結(jié)合蛋白. 世界華人消化雜志  2003;11:1940-194270  成軍, 李莉. 清除乙型肝炎病毒的非細(xì)胞裂解機(jī)制. 世界華人消化雜志  2002;10:73-7671  成軍. 慢性病毒性肝炎發(fā)病機(jī)制的分子生物學(xué)研究. 世界華人消化雜志  2002;10:125-12872  成軍. 慢性丙型病毒性肝炎肝臟脂肪變的機(jī)制及其意義. 世界華人消化雜志  2002;10:999-1003         來(lái)源：世界華人消化雜志

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10