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測(cè)定復(fù)方魚腥草片中金絲桃苷的含量
測(cè)定復(fù)方魚腥草片中金絲桃苷的含量 【摘要】 目的 用RP-HPLC法測(cè)定復(fù)方魚腥草片中金絲桃苷的含量。方法 HPLC用外標(biāo)一點(diǎn)法, Kromasil C-18柱,乙腈-0.1%磷酸溶液(18:82)為流動(dòng)相,柱溫為30℃,流速為1.0ml/min,λ=360nm。結(jié)果 金絲桃苷在0.0675~1.35μg范圍內(nèi)呈良好線性,回歸方程為Y=20.345X-12.118,R2=0.9999,平均加樣回收率100.5%,RSD%為1.4%(n=9)。結(jié)論 方法簡便、準(zhǔn)確,專屬性強(qiáng),測(cè)定結(jié)果重復(fù)性好。為復(fù)方魚腥草片中魚腥草的定量分析提供了科學(xué)有效的方法。
【關(guān)鍵詞】 復(fù)方魚腥草片;金絲桃苷;HPLC
【Abstract】 Objective To establish the method for detemining the content of hyperosidein Fufang Yuxingcao Pion by RP-HPLC. Methods Using Kromasil C18Column, acetonitrile-0.1% phosphoricacid solution(18:82)as the mobile phase,detection wavelength as 360nm and column temperature as 30℃. The flow rate was 1.0ml/min.Results The calibrationcurve was linear at a range of 0.0675~1.35μgfor the hyperosideand linear equation was Y=20.345X-12.118R2=0.9999. The averagerecovery was 100.5% and the related standard deviation(RSD) was 1.4%(n=9). Conclusion This method was simple and accurate and proper,which can be provide for scientific quantitative analysis method of hyeroside in Fufang Yuxingcao Pion,and the reduplicate of the result was good.
【Key words】 fufang yuxingcao tablet; hyperoside;RP-HPLC
復(fù)方魚腥草片為《中國藥典》收載品種,亦為民間常用藥,具有清熱解毒的功效,用于外感風(fēng)熱所致的急喉痹、急乳蛾,癥見咽部紅腫、咽痛;急性咽炎、急性扁桃體炎見上述癥候者。本方由魚腥草、黃芩、金銀花、連翹等5味中藥經(jīng)提取加工制成。據(jù)現(xiàn)行藥典及多數(shù)文獻(xiàn)的報(bào)道,對(duì)復(fù)方魚腥草片的質(zhì)量控制多以黃芩苷作為指標(biāo)進(jìn)行研究。而在實(shí)際處方中,魚腥草所占的量高達(dá)一半以上,為君藥,故控制其中的魚腥草的含量極其必要。現(xiàn)經(jīng)實(shí)驗(yàn)論證,對(duì)方中的魚腥草中所含的金絲桃苷的含量測(cè)定方法進(jìn)行方法學(xué)研究,認(rèn)為線性、重復(fù)性、回收率、精密度等均較理想。
1 儀器與試藥
Agilent 1100系列高效液相色譜儀、G1322A(DEGASSER)溶劑脫氣器、G1311A(QuatPump)四元泵、G1313(ALS)自動(dòng)進(jìn)樣器、 G1316A(COLOM)柱溫箱、G1315B(DAD)檢測(cè)器及Agilent工作站;UV-可見紫外分光光度計(jì)(SHIMADZU);乙腈為色
譜純,其余均為分析純;對(duì)照品金絲桃苷Hyperoside(批號(hào)1521-200202)購于中國藥品生物制品檢定所;樣品復(fù)方魚腥草片由海正藥業(yè)提供(批號(hào)為050301,050302,050303)。
2 測(cè)定方法的研究
2.1 測(cè)定波長的確定 取金絲桃苷的甲醇溶液做光譜圖測(cè)定,在360nm處有最大吸收,故檢測(cè)波長選定360nm。
2.2 流動(dòng)相的選擇 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及《中國藥典》的采用的流動(dòng)相,比較了(1)乙腈-甲醇-四氫呋喃(1:1:19.4:78.6);(2)乙腈-0.1%磷酸(16:84),并設(shè)定柱溫為30℃。根據(jù)上述二種流動(dòng)相的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,認(rèn)為流動(dòng)相(2)較理想。經(jīng)調(diào)整,將"色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)"確定為用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;乙腈-0.1%磷酸(W/V)(18:82)為流動(dòng)相;流速為1.0ml/min;檢測(cè)波長:360nm;柱溫30℃。理論板數(shù)按金絲桃苷峰計(jì)算應(yīng)不低于4000。色譜圖1、2、3。圖1 金絲桃苷對(duì)照品色譜圖2 復(fù)方魚腥草片樣品圖圖3 缺魚腥草陰性樣品圖
2.3 提取方法選擇 經(jīng)查閱相關(guān)資料,對(duì)提取方法、提取溶劑、溶劑用量、提取時(shí)間進(jìn)行考察,采用正交表L9(34)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。見表1,2。表1 復(fù)方魚腥草片含量測(cè)定法正交試驗(yàn)的因素表2 復(fù)方魚腥草片含量測(cè)定法正交試驗(yàn)的計(jì)算從對(duì)金絲桃苷進(jìn)行正交試驗(yàn)的簡單計(jì)算來看,其中提取方法的影響相對(duì)較為明顯,它的極差最大,其余各項(xiàng)的極差小,說明這些因素對(duì)金絲桃苷幾乎沒有什么影響。結(jié)合經(jīng)濟(jì)和環(huán)保等因素以及相對(duì)比較考慮,認(rèn)為最佳的提取方案為采用60%的乙醇,加入樣品50倍量的溶劑,回流提取40min。按此條件,又對(duì)同一批樣品進(jìn)行復(fù)核試驗(yàn),根據(jù)復(fù)核試驗(yàn)的結(jié)果,金絲桃苷的平均含量為0.3512mg/g,與正交試驗(yàn)中的最大值0.3440mg/g相比較提高2.1%,由此證明所選最佳方案比較合理的。
2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、定量限、檢測(cè)限 將對(duì)照品金絲桃苷配制成不同濃度的溶液,如表3。表3 線性關(guān)系考察
2.5 對(duì)照品溶液及供試品溶液的制備
2.5.1 對(duì)照品溶液的配制 取經(jīng)真空干燥24h的金絲桃苷對(duì)照品12.5mg,精密稱定,置50ml量瓶中,加甲醇使溶解,并稀釋至刻度,搖勻備用。精密吸取上述對(duì)照品溶液1ml,置10ml量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,制成每1ml含金絲桃苷25μg的溶液,作為對(duì)照品溶液。
2.5.2 供試品溶液的制備 取本品20片,除去包衣,精密稱定,研細(xì),取1.0g,置圓底燒瓶中,精密加入60%乙醇50ml,稱定重量,加熱回流提取40min,放冷,再稱定重量,用60%乙醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液25ml,蒸干,殘?jiān)?0%乙醇溶解并定容到5ml量瓶中,搖勻,以微孔濾膜(0.45μm)濾過,取續(xù)濾液作為供試品溶液。
2.5.3 測(cè)定法 分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μl,注入液相色譜儀,測(cè)定,即得。
2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)為050301的本品,按上述供試品溶液的制備方法,制備6份樣品,按法測(cè)定,結(jié)果見表4。表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果
2.7 回收率試驗(yàn) 精密稱取本品(批號(hào):050301)測(cè)定量的半量按高、中、低取樣品各3份,分別加入濃度為0.1510mg/ml的金絲桃苷對(duì)照品溶液1.2、1.0、0.8ml,按上述供試品溶液的制備方法,按法測(cè)定。見表5。表5 回收率試驗(yàn)結(jié)果
2.8 精密度和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取批號(hào)為050301的樣品1.0g,精密稱定,按制備方法制成供試品溶液,同法測(cè)定6次,金絲桃苷的RSD為0.3%。見表6。 表6 精密度試驗(yàn)取同一樣品分別在0、1、2、4、12、24h測(cè)定,金絲桃苷的RSD為0.4%,說明該成分在制劑中提取后較為穩(wěn)定。見表7。表7 穩(wěn)定性試驗(yàn)
2.9 樣品測(cè)定 取批號(hào)為050301、050302、050303的三批復(fù)方魚腥草片樣品,分別進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見表8。表8 樣品測(cè)定表由上述結(jié)果可知,此含量測(cè)定方法可運(yùn)用于復(fù)方魚腥草片中金絲桃苷的含量測(cè)定。
3 討論
本品樣品的制備條件,經(jīng)按正交設(shè)計(jì)多因素提取比較,也進(jìn)行了方差分析,結(jié)果幾乎不呈顯著性,說明金絲桃苷在所設(shè)的因素中互相影響較小,也說明它在甲醇和乙醇中溶解性都比較好。為此做了簡單的計(jì)算得出了比較合理的樣品溶液的制備方法。
對(duì)魚腥草藥材的含量也做了測(cè)定,魚腥草藥材含金絲桃苷為0.32mg/g,按制劑中每片含有魚腥草的量來計(jì)算,計(jì)算金絲桃苷的轉(zhuǎn)移率為80%以上。由于本品中含的魚腥草大部分為生藥粉,所以制劑中的轉(zhuǎn)移率相對(duì)比較高,也使得本品在臨床治療感冒的效果比較好。
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