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HPLC法測定不同產(chǎn)地的雞血藤中原兒茶酸的含量
HPLC法測定不同產(chǎn)地的雞血藤中原兒茶酸的含量 【摘要】 目的 建立雞血藤的含量測定方法。方法 采用高效液相色譜法測定了原兒茶酸的含量, C18色譜柱(250mm×4.6mm, 5μm),流動相為甲醇-水-冰醋酸(25:75:0.2),流速1.0ml/min,檢測波長260nm。結(jié)果 原兒茶酸與樣品中其他組分分離效果較好,原兒茶酸在31.1~93.3μg范圍具有良好線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù) r = 0.9996; 平均回收率為99.49%,RSD為1.58%(n=6)。結(jié)論 采用此法測定雞血藤中原兒茶酸的含量,準確可靠,可用于該藥材的質(zhì)量控制。
【關(guān)鍵詞】 雞血藤 原兒茶酸 高效液相色譜法
【Abstract】 Objective To establish the method of detemtemine for Spatholobus suberectus Dunn.Methods HPLC method was developed for the determination of protocatechuic acid in Spatholobus suberectus Dunn. The separation was performed on C18 column with methyl alcohol-water- HAC(25:75:0.2) as a mobile phase where the flow rate was 1.0mL/min. The detection wavelength was set at 260 nm.Results A satisfactory separation between protocatechuic acid and impurity was obtained. The calibration curve was linear over the range from 31.1~93.3μg, r = 0.9996; The average recovery was 99.49% , and RSD為1.58%(n=6).Conclusion The method was accurate and can be used for the detemrmination of constituents for Spatholobus suberectus Dunn.
【Key words】 spatholobus suberectus dunn;protocatechuic acid;HPLC
雞血藤為豆科植物雞血藤Spatholobus suberectus Dunn的干燥藤莖,別名血風(fēng)藤、大血藤、血風(fēng)、活血藤。雞血藤為常用活血化瘀中藥,具有補血、活血、通絡(luò)作用【1】�！吨袊幍洹肥蛰d了1 個種,主要分布在廣西、云南、貴州等地,雞血藤可極顯著的使環(huán)磷酰胺致貧血小鼠的紅細胞值、血紅蛋白值和白細胞值上升【2】,能擴張外周血管,增加器官血流量,實驗證實對犬股動脈有明顯擴張作用【3】,對免疫系統(tǒng)具有雙向調(diào)節(jié)作用【3】,能降低血脂、抗動脈樣硬化作用【4】。雞血藤中含有多種化學(xué)成分,但《中國藥典》中并無含量測定方法,為此,筆者采用HPLC法測定了雞血藤藥材中原兒茶酸的含量,方法簡便、靈敏、準確,對雞血藤藥材的質(zhì)量鑒定有一定的參考價值。
1 儀器與試藥
高效液相色譜儀:島津LC-10A液相色譜儀,
SPD-10A紫外檢測器,南寧威瑪龍色譜工作站,HT-230A柱溫箱。色譜柱為Diamonsil(TM) 鉆石C18柱(250mm×4.6mm,5μm);LIBROR AEL-160型萬分之一電子分析天平;DS-250A(功率)型超聲清洗儀。原兒茶酸對照品(批號:809-200102)購自中國藥品生物制品檢定所; 雞血藤藥材產(chǎn)自廣西、云南、貴州,由貴州大學(xué)生物與科學(xué)學(xué)院生物系關(guān)平教授鑒定為Spatholobus suberectus Dunn的干燥根莖。甲醇為色譜純,水為重蒸餾水,其余試劑均為分析純。
2 方法與結(jié)果
2.1 色譜條件 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;甲醇-水-冰醋酸(25:75:0.2)為流動相;檢測波長為260nm。理論塔板數(shù)按原兒茶酸峰計算應(yīng)不低于3000。對照品與樣品色譜圖見圖1。
2.2 對照品溶液的制備 精密稱取原兒茶酸對照品適量,加酸性水(100ml水中加1mol/L的HCL 0.5ml)制成每1ml含3μg的溶液,即得。
2.3 供試品溶液制備 取本品細粉1g,精密稱定,加水回流2次,每次20ml,濾過,合并濾液并濃縮至約2ml,加入甲醇10ml,濾過,濾液揮干,再加入乙酸乙酯20ml和 1mol/L的鹽酸0.5ml,超聲30min,濾過,濾液揮干,殘渣加20ml酸性水(100ml水中加1mol/L的 HCL 0.5ml)超聲5min使溶解,濾過,濾液過微孔濾膜,作為藥材供試品。
測定法:分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各l0μl,注入高效液相色譜儀,按上述色譜條件,以外標(biāo)法計算含量。見圖1、圖2。
2.4 線性關(guān)系考察 精密量取原兒茶酸對照溶液配制成1、2、3、4、5μg/ml,分別取10μl注入高效液相色譜儀,進行原兒茶酸含量測定,以原兒茶酸峰面積 A 對原兒茶酸濃度 C 進行線性回歸,線性回歸方程:A=46033C -289.75,線性范圍:0.01~0.05μg,相關(guān)系數(shù) r = 0.9996。根據(jù)實驗結(jié)果,原兒茶酸在0.01~0.05μg 范圍內(nèi),峰面積與進樣量呈良好的線性關(guān)系。
2.5 精密度考察 取同一對照品,分別重復(fù)進樣6次,測定結(jié)果,對照品溶液中原兒茶酸RSD=0.50%(n=6)。
2.6 重復(fù)性試驗 取本品6份,精密稱定樣品,按【樣品含量測定】項下的方法操作,制成供試品溶液,測定原兒茶酸的平均含量為57.48μg/g,RSD為1.76%。2.7 穩(wěn)定性試驗 將供試品溶液在室溫下貯存,于0、2、4、6、8h測定,結(jié)果樣品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定, RSD為1.77%。
圖1 原兒茶酸對照品HPLC色譜圖圖2 樣品HPLC色譜圖2.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的樣品共6份,分別加入等量原兒茶酸對照品,照供試品方法制備,測定含量,原兒茶酸平均回收率為98.32%, RSD=1.64%( n=6) ,結(jié)果見表1。表1 原兒茶酸回收率實驗結(jié)果
2.9 不同產(chǎn)地雞血藤中原兒茶酸的含量測定 按2. 3項下方法,制備供試品溶液,測定3個產(chǎn)地雞血藤藥材中原兒茶酸的含量,測定結(jié)果見表2。
3 討論
3.1 原兒茶酸屬有機酸,極性較大,選擇反相色譜法,流動相選擇甲醇:水(15:85)的體系,出峰時間較長,且峰形較寬;選用甲醇:水(25:75)的體系,出峰時間適中,峰形仍較寬;故選用甲醇:水:冰乙酸(25:75:0.2)的體系,出峰時間約為9min,峰形尖銳,理論板數(shù)達到3000以上,達到分離要求。表2 不同產(chǎn)地雞血藤中原兒茶酸的
3.2 雞血藤粉末采用不同提取方法包括 50%、80%甲醇索氏提取4h,50%、80%甲醇回流提取2h,醋酸乙酯超聲30min,醋酸乙酯加水(1:1)超聲30min,水提取醇沉后乙酸乙酯萃取;發(fā)現(xiàn)水提取醇沉后乙酸乙酯萃取的方法,含量較高且分離度也好,但是萃取過程中的重復(fù)性差,考慮到有機酸在酸性水中用乙酸乙酯萃取效果較好,試用少量酸性水加乙酸乙酯直接超聲的方法,獲得了含量較高且分離度也好的結(jié)果,最后的定量溶液用酸水不用甲醇也是為了達到較好分離效果而定的。
3.3 由于市售的雞血藤藥材混用品較多,因此制訂雞血藤藥材的質(zhì)量標(biāo)準是非常必要的,從高效液相結(jié)果可以看出,用原兒茶酸檢測雞血藤藥材質(zhì)量是可行的。筆者認為,如果在定性檢測芒柄花素的同時,能加上原兒茶酸的含量測定,就能更好的控制雞血藤藥材的質(zhì)量。
【參考文獻】
1 國家藥典委員會.中國藥典(一部).北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005,134.
2 羅霞,陳東輝,余夢姚,等. 雞血藤煎劑對小鼠紅細胞增值的影響. 中國中藥雜志,2005, 30(6):477-479.
3 崔艷君,陳若蕓. 雞血藤化學(xué)和藥理研究進展.天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2002,15(4):72-78.
4 王巍.雞血藤、鬼箭羽和土鱉蟲調(diào)脂作用的比較.中國中藥雜志,1991,16(5):299-301.
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