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RU486 誘導(dǎo)調(diào)控系統(tǒng)
RU486 誘導(dǎo)調(diào)控系統(tǒng) 隨著基因治療研究的不斷深入,目的基因的精確表達(dá)已經(jīng)成為首要問(wèn)題。由于解決上述問(wèn)題最好的方法就是擁有一系列復(fù)雜嚴(yán)密的基因調(diào)控系統(tǒng),所以研究者們一直在尋求一種高效可靠的誘導(dǎo)調(diào)控體系,而RU486 誘導(dǎo)調(diào)控系統(tǒng)就是目前找到的較好的一種。近十年來(lái)這一系統(tǒng)的研究已很廣泛,它的結(jié)構(gòu)也有幾次大的改進(jìn),現(xiàn)就此予以綜述。
一 RU486調(diào)控系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)
1 RU486調(diào)控系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)
RU486 調(diào)控系統(tǒng)是1994 年被Wang 等[1]提出的,它由嵌合調(diào)控子反式作用調(diào)控區(qū)和目的基因區(qū)兩部分組成。反式作用調(diào)控區(qū)含有任意啟動(dòng)子控制下的嵌合調(diào)控子(chimeric regulator, GLVP),后者是一種嵌合型的可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子,它包括酵母轉(zhuǎn)錄因子Gal4 的DNA 結(jié)合區(qū)(Gal4DBD)、單純皰疹病毒蛋白VP16 激活區(qū)(VP16AD)和PR-891 突變體改良后的C 末端配體結(jié)合區(qū)(PRLBD-891)三部分。目的基因區(qū)是指在最小啟動(dòng)子(TATA盒或胸腺嘧啶脫氧核苷激酶啟動(dòng)子tk)和四個(gè)Gal4 DNA結(jié)合區(qū)串聯(lián)體(p17×4)調(diào)控下的目的基因,如圖1。
圖1 RU486 調(diào)控系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖
在GLVP中,Gal4DBD 代替了孕酮受體的DNA結(jié)合區(qū),從而避免了任何激活內(nèi)源性孕酮敏感性基因的可能,并且由于GAL4 DBD在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不
存在,目前也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何哺乳動(dòng)物的靶基因可以被Gal4激活,所以這一調(diào)控子只會(huì)調(diào)控目的基因的表達(dá),而不會(huì)影響任何內(nèi)源基因[1]。PR-891是指野生型孕酮受體在891位點(diǎn)平頭切斷造成的突變體,因此其不能與孕酮受體激活劑R5020 結(jié)合,但卻可以與抗孕酮片RU486結(jié)合,從而在RU486存在時(shí)激活孕酮受體介導(dǎo)的基因。這可能是由于PR-891比野生型受體少42個(gè)氨基酸,而孕酮結(jié)合位點(diǎn)屬于缺失的下游內(nèi),RU486結(jié)合區(qū)則位于上游位置[2]。這就避免了給予RU486 時(shí),激活內(nèi)源性孕酮受體誘導(dǎo)其它基因引起一系列的細(xì)胞反應(yīng)。并且由于反式作用調(diào)控子是一種嵌合型的可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子,所以它不再與孕酮反應(yīng)元件(PREs)或糖皮質(zhì)類固醇應(yīng)答成分(GREs)結(jié)合[3],干預(yù)孕酮受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄,取而代之的是在RU486作用下,這一調(diào)控子僅僅與目的基因區(qū)的Gal4DBD結(jié)合,并激活目的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)[2]。由于PRLBD-891的轉(zhuǎn)活能力較差,而VP16AD,即VP16 的 C末端為酸性,可以直接與轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物中的轉(zhuǎn)錄因子TFIIB、TATA結(jié)合蛋白(TBP)和TBP輔助因子TAFII40相互作用,具有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)活功能。
在目的基因區(qū)內(nèi),啟動(dòng)子有兩種:胸腺嘧啶脫氧核苷激酶啟動(dòng)子(tk)和腺病毒E1b 基因中僅僅包含TATA 盒的最小啟動(dòng)子。Tsai[2]等使用氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)作報(bào)告基因?qū)Χ哌M(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),p17x4-TATA-CAT 比p17x4-tk-CAT 轉(zhuǎn)染時(shí)CAT 基礎(chǔ)活力明顯要低一些;而給予RU486 后,前者的CAT 效能可達(dá)大約50倍,后者僅有10~15倍。這可能是由于tk啟動(dòng)子中含有GC 和CAAT 盒等序列,從而使轉(zhuǎn)錄效能較大。所以TATA盒啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)應(yīng)用于要求目的基因的基礎(chǔ)表達(dá)很低時(shí),而在基礎(chǔ)活力稍高能夠耐受,要求轉(zhuǎn)錄效能很大時(shí)應(yīng)使用tk 啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)。對(duì)于p17x4,Gal4 DNA結(jié)合區(qū)的四個(gè)串聯(lián)體則在這一系統(tǒng)中可以提供最大的轉(zhuǎn)錄效能。
2 RU486 調(diào)控系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)改進(jìn)
為了使RU486 調(diào)控系統(tǒng)將來(lái)能夠應(yīng)用于人類的基因治療,降低細(xì)胞毒性和免疫原性,Mark等[4]1999年使用NFκB家族成員――人的p65激活區(qū)(286~550)替代VP16激活區(qū),構(gòu)建出新的RU486反式作用調(diào)控區(qū)(GLP65),以減少VP16 激活區(qū)可能帶來(lái)的免疫反應(yīng)。他們發(fā)現(xiàn)使用TATA盒啟動(dòng)子啟動(dòng)目的基因時(shí),在沒(méi)有RU486的情況下,GLP65的基礎(chǔ)活力明顯低于GLVP;給予RU486后兩個(gè)調(diào)控子均表現(xiàn)出配體劑量依賴性的目的基因表達(dá),這時(shí)GLVP組目的基因的表達(dá)更多,不過(guò)由于GLP65的基礎(chǔ)值很低,所以RU486給予時(shí),目的基因的表達(dá)倍數(shù)會(huì)更高。tk做目的基因啟動(dòng)子時(shí),上述兩種RU486系統(tǒng)則不管是否給予配體,兩者的作用相當(dāng)。所以在使用GLP65 時(shí),最好選用TATA 盒啟動(dòng)子作為目的基因的啟動(dòng)子。
另外,Mark 等[4]在反式調(diào)控區(qū)與目的基因區(qū)之間插入小雞β-球蛋白5’端區(qū)域作為絕緣子(INS)將二者分隔,使目的基因在沒(méi)有RU486的情況下不受調(diào)控系統(tǒng)的調(diào)節(jié)而產(chǎn)生表達(dá)。但是他們發(fā)現(xiàn)在活體大鼠模型,沒(méi)有RU486 表達(dá),有無(wú)絕緣子都不會(huì)有目的基因的表達(dá);但是HELA 細(xì)胞水平上,不含絕緣子者的目的基因則會(huì)有較少的表達(dá),而含絕緣子者沒(méi)有。
二 RU486調(diào)控系統(tǒng)的激活
RU486 調(diào)控系統(tǒng)的激活過(guò)程與甾體類激素被其配體激活相似。反式作用調(diào)控子可以在不同的組織定向啟動(dòng)子作用下,在各自靶向的組織或細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。當(dāng)存在RU486 時(shí), RU486 與PRLBD-891 相結(jié)合,促使反式作用調(diào)控子發(fā)生構(gòu)象變化形成二聚體而激活,激活的反式作用調(diào)控子與目的基因上游的Gal4 DNA 結(jié)合區(qū)四聚體結(jié)合,從而啟動(dòng)目的基因的表達(dá),如圖2。反之,在沒(méi)有RU486 的情況下,由于反式作用調(diào)控子的構(gòu)象不會(huì)發(fā)生變化,所以RU486 調(diào)控系統(tǒng)不能被激活,即目的基因不能轉(zhuǎn)錄表達(dá)。這樣,RU486 調(diào)控系統(tǒng)便可根據(jù)RU486 的量及給予時(shí)間,對(duì)目的基因的表達(dá)水平及其表達(dá)時(shí)程的長(zhǎng)短進(jìn)行控制[2]。
圖2 RU486 調(diào)控系統(tǒng)激活示意圖
三 RU486調(diào)控系統(tǒng)的特點(diǎn)
1. 調(diào)控子的激活依賴于RU486 的給予。在沒(méi)有RU486 的情況下,調(diào)控子所表達(dá)的蛋白沒(méi)有毒性,也不傳遞表型,調(diào)控子不能激活目的基因的表達(dá)。只有給予RU486激活調(diào)控子后,目的基因才會(huì)表達(dá)蛋白。
2. RU486調(diào)控系統(tǒng)在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控目的基因的表達(dá),所以可以直接控制后者的表達(dá)。
3. RU486給予量很小,僅僅能夠激活調(diào)控子,并不能抑制內(nèi)源性孕酮受體或糖皮質(zhì)激素受體的功能。眾所周知,RU486作為孕酮和糖皮質(zhì)激素的拮抗劑時(shí),它的濃度范圍須達(dá)微克分子級(jí),所以在臨床使用中RU486 作為流產(chǎn)藥物的劑量應(yīng)達(dá)600mg或10mg/kg。然而,在RU486 調(diào)控系統(tǒng)中的RU486只需很少的濃度就可使目的基因表達(dá)。Wang等曾做RU486的濃度對(duì)照實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),當(dāng)RU486 濃度僅有0.1nmol/l 時(shí)即可誘導(dǎo)目的基因的表達(dá),并且系統(tǒng)達(dá)到最大活力時(shí)的濃度也僅須1nmol/l,這一劑量要比產(chǎn)生內(nèi)源拮抗作用的濃度低 1000倍[1]。
4. 調(diào)控過(guò)程是可逆的,且其使目的基因大量表達(dá)。RU486停藥后目的基因表達(dá)停止,RU486的重復(fù)給予也會(huì)重復(fù)誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)。
5. RU486調(diào)控系統(tǒng)非常適用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的基因治療。因?yàn)榉肦U486后,其很容易通過(guò)血腦屏障,在臨床中可以安全使用。
四 RU486調(diào)控系統(tǒng)的應(yīng)用
1 RU486調(diào)控系統(tǒng)在單純皰疹病毒載體(HSV)中的調(diào)控
Oligino[5]等將RU486系統(tǒng)引入無(wú)復(fù)制能力HSV載體中,lacZ為目的基因的目的基因區(qū)(p17x5-TATA-lacZ)插入HSV的胸腺嘧啶脫氧核苷激酶位點(diǎn),反式作用調(diào)控區(qū)(VP-GL)置入同一載體的糖蛋白C 位點(diǎn),構(gòu)建成HSV 重組病毒 GVHLZ。在病毒轉(zhuǎn)染Vero 細(xì)胞24h后,他們發(fā)現(xiàn)如果不給RU486,lacZ表達(dá)很低;若將細(xì)胞培養(yǎng)在含10-7mol/L的RU486基質(zhì)中時(shí),lacZ就會(huì)大量表達(dá)。并且, 10-7mol/L的RU486 即可使目的基因表達(dá)達(dá)最大。將GVHLZ 注入SD 大鼠海馬后12 和36h,給予RU486 或生理鹽水作對(duì)照,48h 后處死大鼠取出海馬進(jìn)行檢測(cè),Oligino 發(fā)現(xiàn)lacZ表達(dá)比對(duì)照組高達(dá)150 倍。
2 RU486調(diào)控系統(tǒng)在腺病毒載體(Ad)中的調(diào)控
Magnus等[6]首次將RU486系統(tǒng)引入重組腺病毒載體中,CAT 作為報(bào)告基因與p17x5-TATA 結(jié)合插入Ad 中形成AdG5TripCAT,反式作用調(diào)控區(qū)插入Ad 形成Ad5dl309,將兩者共轉(zhuǎn)染HeLa 細(xì)胞。他們?cè)谵D(zhuǎn)染開(kāi)始給予RU486 后16h 用 ELISA法檢測(cè)CAT的表達(dá),發(fā)現(xiàn)CAT的表達(dá)隨RU486給予量增加而逐漸增大,當(dāng)RU486 達(dá)4umol/l時(shí)CAT達(dá)最大。
2004年,錢程[7]等成功構(gòu)建出RU486調(diào)控并攜帶IL12的第三代腺病毒,并將其進(jìn)行了體外及體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)RU486可以誘導(dǎo)和調(diào)控IL12的表達(dá),這種誘導(dǎo)呈劑量依賴性變化,并且在調(diào)整RU486 的給藥間隔和重復(fù)給藥,IL12 的表達(dá)也會(huì)隨其波動(dòng)變化或維持在一定水平,RU486 調(diào)控系統(tǒng)的基因開(kāi)關(guān)作用表現(xiàn)完全。最近,Schillinger[8]等也將RU486 誘導(dǎo)調(diào)控系統(tǒng)引入到高血壓的基因治療,將RU486 調(diào)控系統(tǒng)控制的心房利尿肽(ANP)插入到第三代腺病毒載體中,從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)ANP表達(dá)的劑量和時(shí)程控制。并且第三代腺病毒的超大容量、低免疫源性和低細(xì)胞毒性等優(yōu)點(diǎn)使得這一系統(tǒng)更加完美。
3 RU486 調(diào)控系統(tǒng)在果蠅中的調(diào)控
Gregg Roman[9]等利用RU486調(diào)控系統(tǒng)對(duì)轉(zhuǎn)入果蠅的目的基因進(jìn)行時(shí)間和空間的調(diào)控。他們將RU486調(diào)控系統(tǒng)插入到P{Switch}放大檢測(cè)元件構(gòu)成的質(zhì)粒注入果蠅胚胎中,待果蠅4天大時(shí)給予RU486飲食。結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過(guò)RU486基因開(kāi)關(guān)可以對(duì)目的基因進(jìn)行時(shí)序上的調(diào)控,在給予RU486飲食后1h即可得到非常高濃度的表達(dá),3h后指示針可以檢測(cè)到目的基因的活力。并且RU486的給予不會(huì)引起任何的不良反應(yīng),它不會(huì)增加果蠅的致死率,也不會(huì)影響果蠅的趨光性、趨地性和逃避反應(yīng)等行為,僅有基因開(kāi)關(guān)的誘導(dǎo)功能。Osterwalder[10]等則利用 RU486調(diào)控系統(tǒng)對(duì)組織特異性的基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控,發(fā)現(xiàn)在果蠅胚后期,RU486 調(diào)控系統(tǒng)可以調(diào)控幼蟲(chóng)神經(jīng)肌肉接頭突觸前后的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。
4 RU486 調(diào)控系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的調(diào)控
2005 年Bo 等[11]又將RU486 誘導(dǎo)調(diào)控系統(tǒng)轉(zhuǎn)入到轉(zhuǎn)基因大鼠體內(nèi),通過(guò)控制RU486 的給予觀察轉(zhuǎn)基因大鼠心內(nèi)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。他們使用心臟特異性α 肌球蛋白重鏈(αMHC)啟動(dòng)子調(diào)控GLP65 系統(tǒng),將含有反式作用調(diào)控區(qū)的載體注射入FVB/N受精卵的前核得到αMHC-GLP65轉(zhuǎn)基因大鼠,然后同樣方法得到含人生長(zhǎng)激素目的基因區(qū)(17X4-tk-hGH)的轉(zhuǎn)基因大鼠,兩者雜交得到雙重轉(zhuǎn)基因大鼠(αMHC-GLP65/Hgh),然后每天給大鼠腹腔內(nèi)注射RU486(500ug/kg)觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不給予RU486,hGH的表達(dá)始終處于很低的基礎(chǔ)值;而隨著RU486 的不斷給予轉(zhuǎn)基因大鼠的hGH 呈劑量依賴性表達(dá),但在停藥后七天內(nèi)轉(zhuǎn)基因表達(dá)即可降至基礎(chǔ)水平;對(duì)于單轉(zhuǎn)基因αMHC-GLP65大鼠,給予RU486后未發(fā)現(xiàn)任何表型出現(xiàn)。并且他們還首次報(bào)道,這一調(diào)控系統(tǒng)的作用對(duì)于任何年齡的大鼠都可適用。
五 其他的基因開(kāi)關(guān)
目前基因開(kāi)關(guān)的種類已經(jīng)有很多,如四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)、甾體激素、免疫抑制劑、β-D-異丙基硫代半乳糖苷、FK1012 細(xì)胞膜調(diào)控系統(tǒng)等等。雖然這些調(diào)控系統(tǒng)各自有各自的應(yīng)用范圍和優(yōu)點(diǎn),但是其中有些可能會(huì)激活其它的內(nèi)源基因,如 FK1012 細(xì)胞膜調(diào)控系統(tǒng),它是運(yùn)用一種免疫抑制劑FK506 的二聚體FK1012,通過(guò)激活細(xì)胞酪氨酸激酶途徑來(lái)調(diào)控基因表達(dá),因此由于細(xì)胞膜受體激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)干預(yù)多種內(nèi)源基因的表達(dá),所以這一系統(tǒng)無(wú)法調(diào)控特異的目的基因[2]。有些效力較低,或者在動(dòng)物和人轉(zhuǎn)基因運(yùn)用中毒性較大(β-D-異丙基硫代半乳糖苷)。四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)則由于四環(huán)素在骨與其他組織的清除率較慢而引起關(guān)注。
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