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信號通路與急性肺損傷纖維化的研究進(jìn)展
信號通路與急性肺損傷纖維化的研究進(jìn)展 急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distress syndrome, ARDS)是繼發(fā)于感染、休克等多種病理損傷的臨床綜合癥,為重度的急性肺損傷(acute lung injury, ALI)。有研究報道在ARDS 的致死原因中難以控制的肺纖維化約占40%-70%[1],而在參與肺損傷纖維化的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中,轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)是最重要的細(xì)胞因子。Smads 則是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)TGF-β1 的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,目前對Smads 家族研究之所以成為熱點,是因為其對闡明TGF-β1 與急性肺損傷纖維化的關(guān)系開辟了新的途徑。故此,現(xiàn)本文就TGF-β1 及Smads 信號通路在急性肺損傷纖維化中作用的研究進(jìn)展作一綜述。
1 TGF-β1-Smads 信號通路概況
1.1 TGF-β亞型:TGF-β1 最早是由Delaro 和Todaro 于1978 年在研究病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞過程中發(fā)現(xiàn)的,哺乳動物體內(nèi)主要有3 種亞型,即 TGF-β1、2 和3 。TGF-β不同亞型在創(chuàng)傷愈合中的作用不同。如TGF- β1、2 有助于瘢痕組織形成,TGF-β3 具有抗瘢痕作用。
2.2 TGF-β的激活: TGF-β分泌后必須經(jīng)過激活才能發(fā)揮效應(yīng),即 TGF 前體分子LTGF 必須激活為成熟的TGF-β形式才能與受體結(jié)合,然后激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。與大多數(shù)其他激素不同,成熟的TGF-β在分泌后仍然保持與它的前肽共價結(jié)合,成熟的TGF-β的這種復(fù)合物形式不能被信號受體識別,因此被稱為TGF-β前肽。潛在相關(guān)肽(LAP) 與潛在TGF-β連接蛋白(LTBP)經(jīng)二硫鍵共價結(jié)合,LTBP 有利于TGF- β/LAP 復(fù)合物的分泌、儲存和激活。TGF-β的激活需要從蛋白氨基端去掉與LTBP 連接的羧基端前區(qū),當(dāng)LTGF 被蛋白裂解移至細(xì)胞外, TGF-β被激活。這是一個復(fù)雜的過程,涉及LTGF 構(gòu)象改變。若機體受到炎癥或損傷因素如內(nèi)毒素[2]、纖溶酶、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)、活性氧等刺激后TGF-β可被激活[3]。
另一個TGF-β激活劑是血小板反應(yīng)蛋白(TSP-1),它具有調(diào)節(jié)細(xì)胞間的黏附、促進(jìn)血管發(fā)生和基質(zhì)再建的作用。TSP-1 在體外可以通過改變LAP 構(gòu)象激活潛在的TGF-β,激活TGF-β的整合蛋白αV β6,后者正常時僅在上皮細(xì)胞少量表達(dá),在感染或損傷時誘導(dǎo)表達(dá)。通過基因敲除動物的研究證實,整合蛋白αVβ6 誘導(dǎo)TGF-β的激活。整合蛋白αVβ6 -/- 動物可以抵抗大劑量博萊霉素誘導(dǎo)的肺損傷和纖維化[4]。
1.3 TGF-β受體:TGF-β受體(TGFR)有5 種不同類型(Ⅰ-Ⅴ型),其中I 型、Ⅱ型是跨膜絲/蘇氨酸激酶受體,其胞質(zhì)區(qū)段有絲-蘇氨酸激酶活性,與受體后細(xì)胞內(nèi)通訊有關(guān)。如I 型受體胞內(nèi)區(qū)外側(cè)一段富含絲/蘇氨酸殘基稱GS 區(qū),是受Ⅱ型受體磷酸化激活的部位。而I 型、Ⅱ型受體細(xì)胞外區(qū)則富含半胱氨酸殘基。Ⅲ型受體,亦稱為β聚糖,是一個錨著蛋白多糖,無信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)但可提高TGF-β對Ⅱ型受體的親和力[5]。
1.4 TGF-β受體激活:TGF-β首先與相應(yīng)的Ⅱ型受體識別結(jié)合而被磷酸化激活成為具有激酶的活性,再由活化的Ⅱ型受體募集I 型受體,并將I 型受體的GS 區(qū)磷酸化而將其激活,活化的I 型受體與下游底物相互作用,再將信號傳遞下去[6]。給予TGFβⅡ型受體的嵌合體能減輕整合蛋白αVβ6 對的TGF-β的激活,對博來霉素所致的肺損傷具有保護(hù)作用[7]
1.5 Smads 蛋白家族: Smads 家族蛋白在將TGF-β信號從細(xì)胞表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核的過程中起到關(guān)鍵性作用,且不同的Smad 介導(dǎo)不同的TGF-β家族成員的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。TGF-β作為配體形成的受體復(fù)合物,激活Smads 進(jìn)入核內(nèi),共同激活或抑制它們調(diào)節(jié)的靶基因的轉(zhuǎn)錄。根據(jù)結(jié)構(gòu),Smad 蛋白分成R-Smad,Co-Smad 和I-Smad 3 個亞家族,至少包括9 種Smad 蛋白,用Smad l-9 表示,按功能分為3 類:即受體活化型或通路限制性Smad(R-Smads)、共同通路型Smad(Co- Smad)和抑制性Smad(I-Smads)。R-Smads 能被I 型受體激活并與受體形成短暫復(fù)合物,它又分為兩類,即由激活素TGF-β激活的 AR-Smads,包括smad 2、Smad 3:和由BMP 等激活的BR-Smads,包括Smad l、Smad 5、Smad 8 和Smad 9。Co-Smad 包括Smad4,是TGF- β家族各類信號傳導(dǎo)過程中共同需要的介質(zhì)。I-Smads 包括Smad 6 和Smad 7,可與激活的I 型受體結(jié)合,抑制或調(diào)節(jié)TGF-β家族的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[8,9]。
2 急性肺損傷時TGF-β的變化
ARDS 的纖維化(pulmonary fibrosis, PF)是肺部炎癥導(dǎo)致肺泡持續(xù)性損傷及細(xì)胞外基質(zhì)(extra cellular matrix, ECM)細(xì)胞反復(fù)破壞、修復(fù)、重建及過度沉積的過程,是機體組織遭受損傷后的過度修復(fù)反應(yīng)[10]。ARDS 病理過程分為滲出期、增生期和纖維化期[11]。以往研究認(rèn)為肺急性炎癥和纖維化可能是兩個相對獨立的過程,但近年資料表明,在ALI、ARDS 的早期TGF-β1 即被激活[12,13],且肺纖維化程度與ARDS 的死亡率密切相關(guān)[14]。
研究表明:ARDS 患者早期肺泡灌洗液中即可發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的TGF- β1,并且其高表達(dá)與隨后的肺水腫形成、促炎性細(xì)胞因子的釋放[7,15] 以及患者氧合指數(shù)降低均密切相關(guān)[15,16]。Beer 等[17]證實TGF-β能抑制肺表面活性物質(zhì)的生成,并能增加Fas 誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞的凋亡 [18]。多位學(xué)者發(fā)現(xiàn)不同因素誘導(dǎo)的急性肺損傷模型中肺組織TGF-β1 的含量均明顯增高。例如,在機械通氣誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷模型,Imanaka 等[19]發(fā)現(xiàn)肺組織TGF-β1 含量明顯增高的同時伴隨肺組織中性粒細(xì)胞浸潤和巨噬細(xì)胞活化;在失血性休克肺損傷大鼠模型中,Shenkar 等[20]發(fā)現(xiàn)失血后1h 肺泡巨噬細(xì)胞的TGF-βmRNA 表達(dá)即明顯增加,并可見大量中性粒細(xì)胞浸潤和間質(zhì)充血水腫。若給予TGF- β單克隆抗體肺組織的損傷程度可明顯減輕。Wesselkamper 等[21]進(jìn)一步證實,在鎳所致ALI 中,給予TGFβⅡ型受體的嵌合體,能有效減輕鎳所致的肺血管通透性的增高和肺水腫發(fā)生。
TGF-β具有多種生物學(xué)效應(yīng),不僅對多種炎性細(xì)胞如巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞或成纖維細(xì)胞有很強的趨化作用[22,23],還能刺激TNF-α, IL-1β,IL-6 等炎性細(xì)胞因子釋放[24,25]。TGF-β可通過以下三種途徑影響IL-6 的表達(dá):(1)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)H2O2 一過性增加。H2O2 可劑量依賴性誘導(dǎo)IL-6 的基因表達(dá)。而抗氧化劑則可抑制TGF-β誘導(dǎo)的IL-6 的基因表達(dá);(2)刺激鈣離子的內(nèi)流,鈣離子可增加IL-6 的表達(dá),同時調(diào)節(jié)激活蛋白一1 的活性;(3)絲裂原激活的蛋白激酶參與了TGF- β所誘導(dǎo)的IL-6 表達(dá)[25]。
3 TGF-β對細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成的調(diào)控作用
急性肺損傷纖維化的發(fā)生是膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成與降解不平衡的結(jié)果,在ECM 降解過程中,金屬蛋白酶起著非常重要的作用。 TGF-β是最強的細(xì)胞外基質(zhì)沉積促進(jìn)劑,使ECM 合成增加,而降解減少 [26]。TGF-β促進(jìn)ECM 的合成體現(xiàn)在多個環(huán)節(jié):其一是上調(diào)基質(zhì)成分基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯等步驟。例如促使膠原、纖維粘連蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶-1 抑制劑的mRNA 表達(dá)水平增加 [27],促進(jìn)胞外基質(zhì)受體的轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白形成,從而促進(jìn)ECM 的沉積;其二是通過選擇性抑制膠原酶的合成、誘導(dǎo)膠原酶抑制物的產(chǎn)生或抑制蛋白酶抑制劑表達(dá)與激活,最終使膠原降解減少、細(xì)胞外基質(zhì)在肺內(nèi)積聚,使肺泡壁增厚,促進(jìn)纖維化形成。TGF-β對上述兩類酶合成的影響一定程度上可根據(jù)編碼這些蛋白的mRNA 表達(dá)水平得到反映。例如TGF-β 可刺激肺成纖維細(xì)胞產(chǎn)生膠原纖維,誘導(dǎo)I、Ⅳ膠原mRNA 表達(dá);利用支氣管滴注TGF-β的方法建立小鼠支氣管周圍纖維化模型,在使用TGF-β7 天,可檢測到小鼠氣道上皮I 、Ⅲ型膠原mRNA 表達(dá)明顯增加[28]。TGF-βmRNA 及蛋白水平的增加均可上調(diào)大多數(shù)基質(zhì)蛋白 mRNA 水平,導(dǎo)致蛋白合成的增加。
激活蛋白-1(activator protein.1,AP-1)是血小板凝血酶敏感蛋白,也是TGF-β的主要激活物�，F(xiàn)有資料證實,TGF-β促進(jìn)膠原基因轉(zhuǎn)錄的分子機制與Smad 家族的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。 AP-1 被激活后,促使TGF-β與其細(xì)胞膜上的受體結(jié)合,將活化的信號傳遞至細(xì)胞內(nèi),細(xì)胞內(nèi)的Smad 家族(smadl、2、3、4、6 等)將信號進(jìn)一步傳遞到細(xì)胞核內(nèi),激活核內(nèi)轉(zhuǎn)錄蛋白,即轉(zhuǎn)錄信號轉(zhuǎn)導(dǎo)劑和激活劑 (signal transducer and activator of transcription,STAT)-1,啟動膠原蛋白mRNA 的轉(zhuǎn)錄,合成膠原蛋白。
4 TGF-β1-Smads 對肺泡-肺毛細(xì)血管屏障功能的影響
ALI的本質(zhì)是各種損傷因素導(dǎo)致的肺泡-肺毛細(xì)血管屏障功能受損,肺毛細(xì)血管通透性增高的血管滲漏綜合征[29]。近年一系列文獻(xiàn)均證實,TGF-β呈劑量依賴性引起肺血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高[30,31,32]。為進(jìn)一步探討TGF-β1 引起肺血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能障礙的分子機制,一些學(xué)者進(jìn)行了相關(guān)研究。發(fā)現(xiàn)TGF-β 能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)多種信號途徑,如細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(MAPK,如P38,JNK,ERK)、Rho GTPase、蛋白激酶C、磷脂酰肌醇-3-激酶等。其中RhoA 是小G 蛋白家庭成員之一,能調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架和細(xì)胞間連接,導(dǎo)致應(yīng)力纖維形成[30,33]。由于激活后的RhoA 能產(chǎn)生許多生物學(xué)效應(yīng),包括細(xì)胞骨架的重構(gòu)、轉(zhuǎn)錄因子的激活等,因此RhoA 又被稱為肌動蛋白細(xì)胞骨架和細(xì)胞形態(tài)異質(zhì)性的調(diào)節(jié)器。 RhoA 激酶拮抗劑Y-27632 能部分減輕TGF-β1 介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高和細(xì)胞骨架的重構(gòu)。 2006年Lu[34]等證實TGF- β1 通過SMAD2 磷酸化激活P38,進(jìn)而誘導(dǎo)RhoA 活化和內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高,且TGF-β1 對RhoA 的激活有賴于P38 的活化,因為給予P38 活化特異阻斷劑能部分抑制RhoA 的激活。同時Lu 還發(fā)現(xiàn),TGF-β作用后0.5-1 小時SMAD2 磷酸化達(dá)峰值,4 小時后磷酸化水平下降。若應(yīng)用SMAD2 iRNA 技術(shù),那么TGF-β1 所致內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高的效應(yīng)則被逆轉(zhuǎn),提示SMAD2 在TGF-β1 所致內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高機制中起主導(dǎo)作用。
5 Smads信號通路對肺損傷纖維化的影響
Smads 通路是TGF-β主要信號傳導(dǎo)分子,近年離體實驗表明, TGF-β1 處理后肺成纖維細(xì)胞中膠原纖維產(chǎn)生明顯增多。為進(jìn)一步探討TGF-β1 上調(diào)Ⅰ型膠原的機制,Zawel [35]等發(fā)現(xiàn)TGF-β1 處理后肺成纖維細(xì)胞Smad3, Smad4 通路活化,進(jìn)而啟動TGF-β1 的靶基因 collal,timp-1[35,36]的轉(zhuǎn)錄,導(dǎo)致Ⅰ型膠原的表達(dá)增多,從而部分揭示了TGF-β1 促進(jìn)ALI 向ARDS 和肺纖維化發(fā)展的機制。
Zhao 等[37]研究了博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺損傷模型中Smad2、 Smad3 的表達(dá),發(fā)現(xiàn)Smad3 mRNA 在博萊霉素作用后第3 天開始下降,一直持續(xù)到第8、12 天,而Smad2 基本保持不變。提示Smad3 的表達(dá)在肺纖維化中可能起重要作用。一個更重要的發(fā)現(xiàn)是,將攜帶小鼠 Smad7 cDNA、Smad6 cDNA 的重組腺病毒分別通過氣管與博萊霉素同時進(jìn)入兩組小鼠肺內(nèi),結(jié)果Smad7 cDNA 重組腺病毒作用組與Smad6 cDNA 作用組相比,I 型前膠原mRNA 的表達(dá)和羥脯氨酸的含量下降,并且沒有肺損傷纖維化的形態(tài)學(xué)變化;Smad7 的表達(dá)可以抑制博萊霉素引起的Smad2 磷酸化。提示Smad7 而非Smad6 可以阻止博萊霉素誘導(dǎo)的肺損傷纖維化。Smad7 可能成為肺纖維化治療的一個突破點[38]。
Smad3 基因缺陷小鼠和野生型小鼠分別氣管滴注博萊霉素,結(jié)果前者與后者相比,I 型前膠原mRNA 的表達(dá)下降,肺組織羥脯氨酸含量降低,而且從形態(tài)學(xué)觀察,Smad 3 的缺失相當(dāng)程度上減輕了肺損傷纖維化。表明Smad 3 在博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化中起一定作用,Smad 3 在肺損傷纖維化的治療中可能具有一定的實用性[37]。
總之,TGF-β1-Smads 信號通路在ARDS 發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用,但迄今為止它在急性肺損傷纖維化疾病中的確切機制仍不十分清楚,特別時在不同誘因所致ARDS 進(jìn)程中,TGF-β與各種Smad 蛋白表達(dá)的定時定位,不同Smad 蛋白表達(dá)的意義,它們與其他信號通路是如何交叉,以及針對該通路的治療等方面,尚有待進(jìn)一步研究。相信隨著研究的深入,對TGF-β及其信號蛋白的調(diào)控可能是今后ARDS 治療新的有效靶點。
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