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益氣化瘀法促進慢性難愈性創(chuàng)面修復愈合的機制研究
【關鍵詞】 潰瘍
[關鍵詞] 潰瘍; 傷口愈合; 益氣化瘀法
Study on wound healing mechanism of replenishing qi and dissipating stagnation therapy for chronic skin ulcers
KEY WORDS ulcer; wound healing; replenishing qi and dissipating stagnation therapy
慢性難愈性創(chuàng)面,如糖尿病、動脈供血不足、靜脈回流不暢以及壓迫、放射損傷、外傷等引起的潰瘍創(chuàng)面,是中醫(yī)外科常見病、多發(fā)病。因其反復發(fā)作,長期不愈,形成頑固性難愈性潰瘍,愈后又極易復發(fā),少數(shù)尚有癌變可能,因此,慢性難愈性創(chuàng)面是臨床創(chuàng)面修復的一大難題。西醫(yī)學多集中在防止創(chuàng)面感染和對創(chuàng)面進行保護,如抗感染、外科清創(chuàng)術、植皮術、多種敷料和創(chuàng)面覆蓋物、維生素類和鋅制劑等治療措施上,以期使難愈性創(chuàng)面獲得自然愈合。隨著對創(chuàng)面愈合認識的深化,人們已從被動等待狀態(tài)轉向主動調(diào)控,多采用外用生長因子以調(diào)控創(chuàng)面愈合,有一定效果,但仍缺乏安全有效的加速創(chuàng)面愈合的積極措施。我們在傳統(tǒng)“祛腐生肌”、“祛瘀生新”治療原則的基礎上,提出慢性難愈性創(chuàng)面“虛、邪、瘀、腐”的致病學說,以及以“補虛生肌”、“化瘀生肌”為治療大法的學術觀點。在臨床應用益氣化瘀法治療慢性難愈性創(chuàng)面取得顯著療效基礎上,開展了一系列的實驗研究,在大鼠或家兔背部體表成功復制出創(chuàng)傷、創(chuàng)傷加塑料環(huán)肉芽腫、創(chuàng)傷加氫化可的松、糖尿病加創(chuàng)傷、糖尿病加創(chuàng)傷及氣虛血瘀證等五種符合臨床發(fā)病因素和主要病理生理特征的皮膚難愈合性潰瘍的動物模型,探討了益氣化瘀法促進慢性難愈性創(chuàng)面修復愈合的機制。
1 益氣化瘀法治療慢性難愈性創(chuàng)面的中醫(yī)理論基礎
慢性難愈性創(chuàng)面屬中醫(yī)學“潰瘍”范疇。中醫(yī)學對潰瘍治療有著悠久的歷史和良好的療效,歷代醫(yī)學文獻對此都作過闡述,不僅積累了豐富的臨床經(jīng)驗,總結了卓有療效的大量方藥和有關劑型,并且上升到了理論高度,確定了潰瘍形成的病因病機和辨證論治的方法,形成了具有特色的理論體系。如總結出了“腐祛肌生、肌平皮長”的潰瘍愈合規(guī)律;重視潰瘍早期祛腐,后期煨膿長肉;并且認識到局部創(chuàng)面的氣血盛衰、氣血瘀滯對創(chuàng)面愈合至為重要。但對“腐”去“新肌”不生或難生及疤痕形成等難題尚不能得到解決。
我們在長期臨床和實驗研究的基礎上,發(fā)現(xiàn)慢性難愈性創(chuàng)面多有瘡口下陷,膿液稀少,肉芽灰白或黯淡,瘡周皮膚色暗黑、板滯木硬等“虛”、“瘀”之象,認為“久病必虛”、“久病必瘀”、“虛多致瘀,瘀久必虛”。慢性難愈性創(chuàng)面病機演變的特點為“因虛感邪,邪氣致瘀,瘀阻傷正,化腐致?lián)p”,形成了虛、邪、瘀、腐相互作用,互為因果的變化。其中“虛”是受邪條件及血瘀傷正的結果,為發(fā)病的根本原因及決定因素;“邪”既可以是在“虛”的基礎上的外因,又可以是血瘀后的病理產(chǎn)物,為發(fā)病的重要條件;“瘀”為虛、邪的病理產(chǎn)物及生腐之源,為發(fā)病的關鍵。治療上我們主張“祛瘀生新”,提出“化瘀生肌”、“補虛生肌”理論,據(jù)此確立了“益氣化瘀”的治療大法[1]。唐漢鈞教授以此為組方原則研制的復黃生肌愈創(chuàng)油膏及扶正化瘀方治療慢性難愈性創(chuàng)面可以明顯促進與加速創(chuàng)面愈合,減少疤痕形成,提高愈合質量,取得了顯著效果,解決了傳統(tǒng)中醫(yī)學“祛腐生肌”療法“腐凈而肌難生或不生”的臨床難題,拓寬了慢性難愈性創(chuàng)面治療的途徑,完善和發(fā)展了傳統(tǒng)中醫(yī)學的“愈創(chuàng)理論”。
2 益氣化瘀法促進慢性難愈性創(chuàng)面修復愈合的機制
2.1 調(diào)控生長因子的合成和分泌 創(chuàng)面修復愈合是一個連續(xù)的復雜過程,包括創(chuàng)面炎癥反應期、細胞增殖分化及肉芽組織增生期、組織重塑期等主要過程。各種生長因子作用于創(chuàng)面修復不同過程,產(chǎn)生趨化作用、合成分泌作用、增殖分化作用、誘導凋亡、刺激新生血管形成等多種生物效應,從而明顯促進創(chuàng)面修復。生長因子與創(chuàng)面愈合過程的量效關系的研究也表明,只有創(chuàng)面保持一定量的生長因子才對創(chuàng)面修復有促進作用,當創(chuàng)面內(nèi)源性生長因子種類與含量正常平衡失調(diào)或其受體活性呈下調(diào)狀態(tài)時可導致創(chuàng)面修復困難,最終形成難愈性創(chuàng)面[2]。應用益氣化瘀法(復黃生肌愈創(chuàng)油膏)作用于大鼠背部全層皮膚缺損以及使用醋酸氫化可的松復制成的慢性難愈性創(chuàng)面模型,結果使局部創(chuàng)面組織胰島素樣生長因子Ⅰ(insulinlike growth factorⅠ, IGFⅠ)mRNA、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF) mRNA、表皮生長因子受體(receptor of epidermal growth factor,EGFR)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)mRNA表達呈明顯上調(diào),優(yōu)于模型組,提示益氣化瘀法有促進局部創(chuàng)面組織細胞分泌多種內(nèi)源性生長因子的作用,從而加速創(chuàng)面的愈合過程。
轉化生長因子β1(transforming growth factorbeta1, TGFβ1)是一類對創(chuàng)面修復有重要調(diào)控作用的多功能的生長因子,能夠趨化炎性細胞和組織修復細胞向創(chuàng)面聚合,促進成纖維細胞增殖,刺激肉芽組織生長以及修復后期的組織重建等,與創(chuàng)面愈合密切相關[3]。應用益氣化瘀法(復黃生肌愈創(chuàng)油膏)作用于大鼠背部全層皮膚缺損創(chuàng)面模型,結果使創(chuàng)面修復初中期TGFβ1 mRNA高表達,修復后期TGFβ1 mRNA的表達明顯下降,說明中藥有良好的調(diào)控修復過程中TGFβ1 mRNA表達的作用,進而調(diào)控修復進程中的膠原合成,修復初中期促進膠原合成、修復后期抑制膠原的過度合成,從而發(fā)揮良好的促進創(chuàng)面愈合,減少瘢痕形成的作用。
2.2 促進細胞分裂增殖 創(chuàng)面愈合的關鍵之一是修復細胞的增殖。細胞的增殖受多種環(huán)境因素的影響,其中最重要的已知因素為創(chuàng)面愈合過程中相關的生長因子。生長因子表達與創(chuàng)面細胞周期存在相互調(diào)控作用。研究表明,在Gl期中間存在一個細胞分裂的限制點,Gl期細胞停留在限制點內(nèi)則處于休止狀態(tài),一旦越過限制點就進入增殖狀態(tài)。生長因子主要影響細胞是否能越過G1期中的限制點,一旦超越限制點就進入分裂增殖狀態(tài),進行DNA的復制合成;在DNA復制的S期,生長因子的基因表達處于高峰期,以促進創(chuàng)面細胞的增殖;在細胞進入分裂相,復制的細胞分裂達到高峰,不再需要相關生長因子的促分裂作用,G2和M期細胞就可能反饋性下調(diào)其基因表達。研究
表明bFGF促使細胞越過限制點而進入細胞周期,EGF則使越過限制點的細胞順利完成而后的細胞周期,這兩類因子具有相互協(xié)同作用,共同完成細胞周期[4]。臨床研究證實,益氣化瘀法(復黃生肌愈創(chuàng)油膏)能明顯促進新生肉芽組織及上皮組織生長,應用它作用于大鼠背部全層皮膚缺損以及使用醋酸氫化可的松復制的慢性難愈性創(chuàng)面模型,結果使新生肉芽組織S期細胞數(shù)、G2和M期細胞數(shù)及DNA含量明顯增高,同時EGF mRNA和bFGF mRNA表達亦呈上調(diào)狀態(tài),與模型組相比差異有顯著性意義,提示中藥作用于局部創(chuàng)面組織,通過對多種生長因子的協(xié)同作用,促進DNA合成,進而促進細胞增殖,加速創(chuàng)面愈合。
2.3 刺激創(chuàng)面新生血管形成,改善創(chuàng)面的血液循環(huán) 局部組織的缺血可直接影響創(chuàng)傷愈合的程度及其預后,血管再生是創(chuàng)面修復愈合過程中的重要機制,為創(chuàng)面修復愈合的關鍵環(huán)節(jié)。臨床研究發(fā)現(xiàn),益氣化瘀法(復黃生肌愈創(chuàng)油膏)對慢性難愈性創(chuàng)面局部顏色的改變(由紫暗至暗紅至淡紅至紅潤)有明顯的影響,創(chuàng)面顏色轉至紅潤的速度加快和病例數(shù)增加,肉芽組織溫度與周圍皮膚溫度之差增大,均明顯優(yōu)于白玉膏組。應用益氣化瘀法(復黃生肌愈創(chuàng)油膏)作用于大鼠背部全層皮膚缺損以及使用醋酸氫化可的松復制的慢性難愈性創(chuàng)面模型,結果使局部組織毛細血管通透性及創(chuàng)面中點血流值明顯提高,病理形態(tài)學發(fā)現(xiàn)新生毛細血管數(shù)量較多,結合中藥能上調(diào)誘導血管生成的生長因子EGF mRNA、bFGF mRNA的表達,提示中藥能刺激創(chuàng)面新生血管形成,改善創(chuàng)面血供及組織血液灌注量;同時應用益氣化瘀法(復黃生肌愈創(chuàng)油膏)作用于小鼠耳廓,結果使耳廓細動脈、細靜脈口徑擴張,細靜脈血流速度加快,毛細血管開放量明顯增加,提示中藥能改善小鼠耳廓微循環(huán)[5]。
2.4 調(diào)控膠原的合成及代謝 成纖維細胞是創(chuàng)面愈合過程中的主要修復細胞,其生物學效應在創(chuàng)面修復中有至關重要的作用。成纖維細胞所合成的膠原在創(chuàng)面修復中是構成修復組織的主要細胞外基質成分,膠原代謝的結果直接影響創(chuàng)面的修復質量。膠原成分主要為Ⅰ、Ⅲ型膠原,二者共同組成膠原原纖維,其中Ⅰ型膠原是主體,Ⅲ型膠原包繞于外周;但Ⅲ型膠原比例決定膠原纖維的直徑大小及彈性好壞,Ⅲ型膠原含量越高,膠原纖維越細,彈性越好,瘢痕越輕,表明Ⅰ、Ⅲ型膠原比例與創(chuàng)面修復質量好壞密切相關[4]。應用益氣化瘀法(復黃生肌愈創(chuàng)油膏)作用于大鼠背部全層皮膚缺損模型,病理超微形態(tài)學發(fā)現(xiàn)成纖維細胞的胞核規(guī)則,胞質內(nèi)線粒體、內(nèi)質網(wǎng)、核糖體等沒有明顯的擴張,分泌到細胞外的膠原纖維呈有序排列,粗細適中,似正常皮膚結構。模型組成纖維細胞的胞核大,胞質內(nèi)有數(shù)量較多的擴張的粗面內(nèi)質網(wǎng)存在,游離核糖體和線粒體較多,基質內(nèi)膠原纖維數(shù)量多、密集、粗大、排列紊亂。提示中藥組成纖維細胞未呈現(xiàn)明顯的合成狀態(tài),而模型組成纖維細胞表現(xiàn)合成膠原比較旺盛的功能狀態(tài),并且膠原粗大、排列紊亂;還發(fā)現(xiàn)在創(chuàng)面修復初中期中藥有明顯促進膠原合成的作用,且優(yōu)于模型組,在修復后期,中藥組膠原含量增加趨勢明顯降低,接近正常皮膚組,而模型組未見明顯降低趨勢,其膠原含量明顯高于中藥組和正常皮膚組,有非常顯著性差異,說明中藥在修復后期有抑制成纖維細胞合成膠原的功能,這在一定程度上直接抑制了膠原的過度合成。同時發(fā)現(xiàn),在創(chuàng)面修復初中期中藥組和模型組Ⅲ型和Ⅰ型膠原比例無明顯差異,但均較正常皮膚對照組高,在修復后期,中藥組Ⅲ型和Ⅰ型膠原比例明顯高于模型組,但不及正常皮膚對照組,提示中藥能提高Ⅲ型膠原比例。
此外,應用益氣化瘀法(復黃生肌愈創(chuàng)油膏)作用于兔耳腹面全層皮膚缺損模型,結果發(fā)現(xiàn)中藥能降低Ⅰ型前膠原mRNA的表達,從而降低Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA的比值及總體膠原的合成;同時我們檢測了瘢痕組織中降解膠原的膠原酶活性,發(fā)現(xiàn)在正常皮膚中沒有檢測到膠原酶活性,中藥組的膠原酶活性最低,模型組最高,呈現(xiàn)瘢痕腫塊越大,膠原酶活性越高的趨勢。提示瘢痕形成后,膠原的過度沉積或繼續(xù)合成,通過某種機制反饋性地激活膠原酶的活性。說明中藥減少瘢痕形成的機制是在于其在促進愈合過程中就減少了膠原的過度沉積,而不是在瘢 [1] [2] 下一頁 痕的改建過程中實現(xiàn)的。
2.5 調(diào)控創(chuàng)面修復過程中TGFβ1信號轉導分子修復基因Smad3的表達 研究表明,TGFβ1在潰瘍創(chuàng)面組織中含量的變化對潰瘍發(fā)生、修復愈合發(fā)揮核心和關鍵作用。Smad是細胞內(nèi)特異轉導TGFβ1調(diào)控信息的信號轉導分子,它們可將TGFβ1信號直接從細胞膜轉入細胞核內(nèi),并激活靶基因的轉入。其中修復基因Smad3可以調(diào)節(jié)創(chuàng)面愈合,Smad3基因的失控是創(chuàng)面愈合延遲、不愈合或瘢痕過度增生的真正原因[6,7]。應用益氣化瘀法(復黃生肌愈創(chuàng)油膏)作用于大鼠背部全層皮膚缺損以及使用鏈脲佐菌素復制的慢性難愈性創(chuàng)面模型,結果發(fā)現(xiàn),在創(chuàng)面愈合早中期,中藥減少TGFβ1信號轉導分子Smad3的表達,從而抑制早期的炎癥反應及加速中期創(chuàng)面上皮化,促進創(chuàng)面愈合。
2.6 調(diào)節(jié)創(chuàng)面修復基質形成 細胞外基質對創(chuàng)面修復過程中細胞增殖有很大影響,纖維連結蛋白(fibronectin,FN)是一類分子量約440~550 kD的糖蛋白,與纖維原、纖維蛋白原、肝素及硫酸肝素和膠原相結合,共同形成基質,在創(chuàng)面修復中起著重要作用。FN參與創(chuàng)面愈合過程的所有階段,其重要作用有作為趨化因子誘導外周血中的單核細胞、巨噬細胞、上皮細胞、成纖維細胞向傷口運動,可加速創(chuàng)面的清創(chuàng),促進肉芽的形成,加速創(chuàng)面上皮化;FN介導人成纖維細胞、單核細胞、巨噬細胞、上皮細胞等與各種細胞外基質的結合,在細胞的移行、上皮化過程中起支架作用;FN對基質的產(chǎn)生有調(diào)節(jié)作用[4]。應用益氣化瘀法(復黃生肌愈創(chuàng)油膏)作用于大鼠背部全層皮膚缺損模型,結果使局部組織FN含量同模型組相比明顯增多,從而促進創(chuàng)面愈合[8]。
2.7 營養(yǎng)創(chuàng)面 創(chuàng)面營養(yǎng)、微量元素對創(chuàng)面愈合有一定的作用。肉芽組織增生是創(chuàng)面修復愈合的主要環(huán)節(jié)。肉芽組織中各種氨基酸含量與肉芽組織生長好壞及表皮再生密切相關;微量元素Zn是DNA聚合酶和RNA聚合酶的輔酶成分,與細胞的分裂及蛋白質的合成有密切關系;Cu為膠原的形成提供必需的輔助因子。應用益氣化瘀法(復黃生肌愈創(chuàng)油膏)作用于大鼠背部全層皮膚缺損模型,結果使肉芽組織中合成膠原所必需的甘氨酸、脯氨酸、賴氨酸等11種氨基酸的含量明顯提高;作用于大鼠塑料環(huán)肉芽腫模型,結果使局部組織中Zn含量明顯上升,而Cu含量無明顯變化,從而為創(chuàng)面“生肌”提供或積累了物質基礎,起到促進創(chuàng)面愈合的作用[9,10]。
2.8 其它 臨床研究發(fā)現(xiàn),益氣化瘀法(復黃生肌愈創(chuàng)油膏)治療慢性難愈性創(chuàng)面,治療前后炎癥帶寬度明顯縮小,創(chuàng)面滲液細菌培養(yǎng)陽性率較低;動物實驗發(fā)現(xiàn)益氣化瘀法(復黃生肌愈創(chuàng)油膏)組組織病理切片中炎性細胞較少,表
明中藥有一定的抗感染作用。此外,益氣化瘀法(復黃生肌愈創(chuàng)油膏)可改變潰瘍創(chuàng)面的pH值,使其更接近于中性,以利于肉芽組織的生長;可使創(chuàng)面滲出液較多且黏稠,以保持一個濕潤環(huán)境,促進創(chuàng)面愈合。
3 結 語
綜上所述,益氣化瘀中藥通過調(diào)控生長因子的合成和分泌,促進細胞分裂增殖,改善創(chuàng)面的血液循環(huán),調(diào)控膠原的合成及代謝,調(diào)控創(chuàng)面修復過程中TGFβ1信號轉導分子修復基因Smad3的表達,調(diào)節(jié)創(chuàng)面修復基質形成,營養(yǎng)創(chuàng)面等而發(fā)揮多途徑、多靶點、多環(huán)節(jié)、多層次的綜合調(diào)控作用,從而提高機體本身修復能力,并創(chuàng)造一種既利于修復,同時又不破壞正常組織修復進程的生理環(huán)境,促進難愈性創(chuàng)面愈合,有效地預防或減少疤痕形成,提高愈合質量。隨著生物技術的發(fā)展,以生理性再生修復為基礎,追求無瘢痕的創(chuàng)面愈合方式已成為愈合研究的趨勢和主導潮流。我們應當在發(fā)揚中醫(yī)藥治療優(yōu)勢的同時,借助于現(xiàn)代的高科技及生物學成果,建立符合中醫(yī)特點的病證結合的慢性難愈性創(chuàng)面實驗模型,對中醫(yī)藥促進創(chuàng)面生理性修復及組織再生的機制進行深入系統(tǒng)研究,開發(fā)符合國際標準和要求的應用于創(chuàng)面修復愈合的高效藥物。
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