談血管內(nèi)皮細胞生長因子對骨缺損修復的影響

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    【摘要】  探討血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)對肌肉骨膜瓣、松質(zhì)骨顆粒和骨髓聯(lián)合移植修復骨缺損中的影響.[方法]制作家兔橈骨骨缺損模型,在缺損區(qū)用肌肉骨膜瓣、松質(zhì)骨顆粒及骨髓進行聯(lián)合移植,于術后第1、2、4、6、8周時利用光學顯微鏡和免疫組織化學等方法檢測VEGF在骨缺損修復不同階段中對各種細胞內(nèi)的表達情況.[結(jié)果]VEGF在骨缺損修復過程中的不同階段的表達程度不同,在術后1~6周時(即軟骨內(nèi)化骨階段),新生的骨細胞、成骨細胞及軟骨細胞內(nèi)均可見大量的VEGF,其高峰出現(xiàn)在第4周.[結(jié)論]VEGF是骨缺損修復過程中重要的生長因子,聯(lián)合移植有利于骨缺損的快速修復.
    【關鍵詞】  血管內(nèi)皮生長因子類 骨缺損 骨移植
    Effects of vascular endothelial growth factor for repairing bone defect
    ABSTRACT:OBJECTIVETo study the expression and effects of vascular endothelial growth factor (VEGF) for combined transplanting the musculoperiosteal flap, bone marrow and spongy bone granules to repairing bone defect.METHODSSegmental bone defect was created in the mid upper of radial shaft of adult rabbits, and combination of musculoperiosteal flap, bone marrow and spongy bone granules was transplanted to the bone defect. VEGF expression in the different phase of repairing bone defect was defected by immunohistochemistry at postoperative of 1, 2, 4, 6, 8 weeks.RESULTSExpression of VEGF was different in the different phase of repairing bone defect. VEGF was expressed in neo�瞣steocytes, osteoblasts and chondrocytes in the bone defects sites from one to six weeks (phase of os endochondrale) after operation, and the high expression of VEGF was detected at 4 weeks.CONCLUSIONVEGF is key factor in healing bone defects, and combined transplantation makes for repairing the bone defect.
    Key words:vascular endothelial growth factors;bone defect;bone transplantation
    目前,車禍造成的開放性骨折、骨壞死及骨缺損日益增多,而骨折不愈合及骨缺損是治療難點.雖然多種方法可用于修復骨缺損,包括自體骨移植、同種異體骨移植及人工骨移植等,但均有弊端.本實驗通過肌肉骨膜瓣、松質(zhì)骨顆粒及骨髓聯(lián)合移植修復了家兔橈骨骨缺損,并利用免疫組織化學方法觀察了修復效果,旨在為臨床治療骨缺損提供依據(jù).
    1  材料與方法
    取健康家兔30只,體重為2.5~3.0kg,雌雄不限,由延邊大學醫(yī)學部實驗動物科提供,分籠飼養(yǎng).實驗前術區(qū)備皮,常規(guī)消毒,用5g/L利多卡因行局部浸潤麻醉,取雙前肢前內(nèi)側(cè)縱行切口,經(jīng)肌間隙進入,顯露橈骨干,截除橈骨中段15mm,制作骨缺損動物模型,選擇右前肢為實驗肢,左前肢為對照肢.取髂后上棘切口,長度約為20mm,取出15mm×10mm大小的髂骨,刮取其松質(zhì)骨顆粒備用;于脛骨上段前內(nèi)側(cè)切開皮膚約10mm,抽取骨髓2.0mL,自然狀態(tài)下凝固備用.將實驗組旋前圓肌置入骨缺損模型家兔實驗肢骨缺損區(qū),并將松質(zhì)骨顆粒及骨髓植入旋前圓肌組織內(nèi),用橈骨骨膜包裹,用5��0無損傷線仔細縫合骨膜,再逐層縫合切口;而對照肢則未給予任何處理,直接縫合.分別于術后1、2、4、6、8周時隨機選擇模型家兔5只處死,分別于實驗肢及對照肢橈骨骨缺損處取材,置于100g/L甲醛溶液固定24h,EDTA脫鈣4周,每周換液1次,梯度酒精脫水,石蠟包埋,5μm厚組織切片,行HE及免疫組織化學染色.方法為組織切片脫臘,水化,EDTA熱修復,過氧化氫封閉非特異性抗原,PBS沖洗3次,滴加第一抗體,4℃過夜;沖洗3次,滴加第二抗體,室溫孵育10min;PBS沖洗3次,滴加辣根酶標記鏈霉卵白素,室溫孵育10min;PBS沖洗3次,DAB顯色,梯度酒精脫水,二甲苯透明,封片.  2  結(jié)果
    2.1  HE染色表現(xiàn)  術后第1周對照肢炎性細胞減少,有少量纖維組織形成;第2~4周,缺損組織中纖維組織大量形成,但排列紊亂,伴有少量軟骨細胞增生;第4~6周,缺損組織中纖維組織排列整齊,可見軟骨細胞及少量類骨樣組織,呈軟骨內(nèi)化骨;第8周,缺損組織中可見軟骨細胞,僅在骨折端可見骨痂形成,中間仍有纖維結(jié)締組織.術后第1周實驗肢缺損組織中可見大量的間充質(zhì)細胞形成;第2周,可見大量間充質(zhì)細胞向軟骨細胞分化,同時有大量軟骨細胞團形成;第4周,可見大量軟骨細胞與條索狀的新生骨細胞,仍有大量增殖的間充質(zhì)細胞;第6~8周,缺損組織中軟骨內(nèi)化骨已形成完整的骨組織.
    2.2  VEGF的影響  術后第1周對照肢取材組織的炎性細胞、成纖維細胞及血管內(nèi)皮細胞內(nèi)可見大量的VEGF;第2~4周,在骨折端成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞及軟骨細胞內(nèi)可見大量的VEGF(圖1A);第4~6周,在血管內(nèi)皮細胞及軟骨細胞內(nèi)可見少量的VEGF;第8周,在取材組織中未見VEGF.術后第1、2周時實驗肢成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞及軟骨細胞內(nèi)可見大量VEGF;第2~4周,骨折端組織血管內(nèi)皮細胞及軟骨細胞內(nèi)仍可見較多VEGF(圖1B);術后第6周,大量的軟骨細胞內(nèi)仍可見VEGF;術后第8周,在骨細胞中未見VEGF.
    3  討論
    目前,骨折后缺損骨修復的確切機制尚未十分清楚,而骨不連的預防與治療亦是骨科難題.骨折修復是由多種因素參與的復雜的生物學過程,而與成骨有關的血管形成和成骨細胞活性的保持有賴于成骨因子的刺激素[1].VEGF糖蛋白,分子質(zhì)量為34~45ku,可由多種哺乳類動物及人類的胚胎和成年組織中產(chǎn)生,可通過旁分泌強烈地刺激體內(nèi)新生血管的生成,增加血管通透性,對維持血管的正常狀態(tài)和完整性具有重要意義[2,3].VEGF是目前已知的眾多血管生長因子中作用最強[4],其他促血管生成因子的作用均直接或間接地通過增強VEGF表達來實現(xiàn).本實驗用肌肉骨膜瓣、松質(zhì)骨顆粒和骨髓聯(lián)合移植修復長段骨缺損,并用HE、免疫組織化學染色和原位雜交的方法觀察了骨缺損的修復時間與VEGF在細胞內(nèi)表記情況.實驗結(jié)果表明,在早中期骨缺損模型家兔實驗肢缺損處組織中可見大量的毛細血管形成,并伴有移植骨的吸收和軟骨細胞的形成,在中后期見大量的軟骨內(nèi)化骨形成,骨組織進一步得到重建,一些軟骨細胞也經(jīng)鈣化,骨髓腔已初步形成;原位雜交結(jié)果顯示,實驗肢及對照肢家兔缺損處組織細胞內(nèi)均可見大量的VEGF,但實驗肢較對照肢多.本實驗結(jié)果提示,VEGF在肌肉骨膜瓣、松質(zhì)骨顆粒和骨髓聯(lián)合移植修復長段骨缺損修復過程中,具有促進軟骨細胞的分化增殖及軟骨內(nèi)化骨作用,是骨缺損修復的重要生長因子,聯(lián)合移植有利于骨缺損的快速修復.
    【參考文獻】
    [1] Frost HM.The biology of fracture healing[J].Clin Orthop,2002,248:283.
    [2] Ferrara N, Henzel WT.Pituitary follicular cells secrete a novel heparin�瞓inding growth factor specific for vascular endothelial cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2001,161(2):851.
    [3] Shifren TL, Doldi N, Ferrara N, et al..In the human fetus vascular endothelial growth factor is expressed in epithelisl cells and myocytes, but not vascular endothelium:Implications for modre of action[J].J Chon Endovrinol Melab,1998,79(7):316.
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