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益母草主要有效成分分析
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【摘要】 目的 考察益母草野生品和栽培品中主要有效成分水蘇堿和多糖的含量,為人工種植益母草的必要性提供依據(jù)。方法 分別采用薄層掃描法測定水蘇堿,分光光度法測定多糖。結(jié)果 栽培品中水蘇堿和多糖含量普遍比野生品含量高,且含量變化有一定規(guī)律性。結(jié)論 為保證益母草藥材質(zhì)量,應(yīng)該采用人工種植為好。
【關(guān)鍵詞】 益母草;水蘇堿;多糖
益母草來源于唇形科植物益母草 (Leonurus japonicus Houtt.)的新鮮或干燥的地上部分,為婦科經(jīng)產(chǎn)要藥[1,2]。本實(shí)驗(yàn)為考察黔產(chǎn)益母草野生品和栽培品的質(zhì)量,通過測定益母草中主要有效成分水蘇堿和多糖的含量[3,4],對益母草野生品和栽培品的質(zhì)量進(jìn)行比較,為人工種植益母草提供依據(jù),達(dá)到提高益母草藥材質(zhì)量的目的。
1 儀器、試劑與藥材
1.1 儀器與試劑 CS-9301PC雙波長飛點(diǎn)層析掃描儀(日本島津公司);CAMAG LINOMAT V半自動點(diǎn)樣儀(瑞士卡馬公司);定量毛細(xì)管(美國MICROCAPS公司);XS205雙量程電子分析天平,量程:萬分之一和十萬分之一兩檔(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);硅膠G板(青島海洋化工廠);DU-70紫外-可見分光光度計(美國BACKMAN公司);鹽酸水蘇堿對照品購自中國藥品生物制品檢定所,批號:110712-200407;苯酚、濃硫酸和葡萄糖等其他化學(xué)試劑均為分析純;水為蒸餾水。
1.2 藥材 分別采自貴州省惠水縣和貴陽市郊烏當(dāng),藥材樣品均經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院魏升華講師鑒定為紅花益母草Leonurus japonicus Houtt.,本實(shí)驗(yàn)均用益母草地上部分。
2 方法與結(jié)果
2.1 水蘇堿的分析[5]
2.1.1 供試品溶液和對照品溶液的制備 精密稱取干燥益母草樣品粉末約1g,置圓底燒瓶中,加入乙醇約50ml,加熱回流1.5h,放冷,濾過,濾渣及回流容器用乙醇50ml分次洗滌,合并濾液和洗液,蒸干,殘渣用乙醇溶解,轉(zhuǎn)移至10ml容量瓶中,加乙醇稀釋至刻度,搖勻,離心(5000轉(zhuǎn)/min,5min),取上清液作為供試品溶液。精密稱取在105℃干燥3h的水蘇堿對照品適量,加乙醇制成每1ml含2.030mg的溶液,作為對照品溶液。
2.1.2 薄層色譜分析條件 用硅膠G薄層板,點(diǎn)狀點(diǎn)樣,點(diǎn)樣量10μl。以正丁醇-鹽酸-乙酸乙酯(8:3:1)為展開劑,展開,取出晾干后,在 105℃加熱15min,放冷,噴以稀碘化鉍鉀試液-1%三氯化鐵乙醇溶液(10:1)混合溶液至斑點(diǎn)顯色清晰,晾干,立即在薄層板上覆蓋同樣大小的玻璃板,周圍用膠布密封。反射法單波長鋸齒形掃描。波長λS=510nm,狹縫0.4mm×0.4mm。在上述分析條件下對薄層色譜進(jìn)行掃描分析。
2.1.3 線性關(guān)系的考察 用半自動點(diǎn)樣儀在同一硅膠G薄層板上點(diǎn)鹽蘇堿對照溶液2、4、6、8、10、12、14μl,用上述條件展開顯色后進(jìn)行薄層掃描測定,以點(diǎn)樣量(μg)為橫坐標(biāo),峰面積(A)為縱坐標(biāo),求出回歸方程為:Y = 185.75X - 411.09,r=0.996,表明水蘇堿在4.06~28.42μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。由于直線不通過原點(diǎn),因此用外標(biāo)兩點(diǎn)法計算含量。
2.1.4 穩(wěn)定性考察 在同一塊薄層板上分別點(diǎn)8μl樣品溶液和10μl對照品溶液,依上述色譜條件和掃描條件操作,分別在0、0.5、1、1.5、2h掃描測定鹽酸水蘇堿峰面積,結(jié)果峰面積的RSD為0.38%,表明鹽酸水蘇堿在本實(shí)驗(yàn)條件下2h內(nèi)穩(wěn)定。
2.1.5 同板精密度和異板精密度試驗(yàn) 分別在同一薄層板上和在另外5塊薄層板上點(diǎn)同一供試品溶液五個點(diǎn),每個點(diǎn)10μl,并以水蘇堿對照品溶液3、8μl作為隨行標(biāo)準(zhǔn),分別掃描測定其峰面積,按上述分析條件測定,以峰面積計算,同板精密度RSD為1.00%,異板精密度RSD為1.90%。
2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn)和回收率試驗(yàn) 分別稱取同一益母草藥材5份,按2.1.1“供試品溶液的制備”和2.1.2“薄層色譜分析條件”操作,測得水蘇堿平均含量為1.09%,RSD為2.52%。精密稱取鹽酸水蘇堿平均含量為1.09%的益母草藥材5份,每份約0.5g,精密加入水蘇堿對照品5.00mg,同時加入約50ml乙醇回流提取,按上述“供試品溶液的制備”方法和“薄層色譜分析條件”進(jìn)行溶液制備和測定,結(jié)果5次回收率平均值:99.76%,RSD=1.34%。
2.1.7 含量測定與結(jié)果 按上述“供試品溶液制備方法”和“ 薄層色譜分析條件”對各樣品進(jìn)行溶液制備和測定,結(jié)果見表1。表1 益母草樣品中水蘇堿和多糖含量測定結(jié)果
2.2 多糖的分析[6]
2.2.1 供試品溶液和對照品溶液的制備 精密稱取干燥益母草粉末約0.3g,置圓底燒瓶中,精密加入50ml蒸餾水后稱重,加熱回流提取3h,冷卻后稱重,用水補(bǔ)足損失量,搖勻,過濾,棄去初濾液,取續(xù)濾液4ml于50ml容量瓶中,用水定容至刻度,作樣品液。從樣品液中精密量取2ml于25ml比色管中,分別精密加入5%的苯酚1ml、濃硫酸5ml,搖勻,置沸水浴中保持15min后取出,冷至室溫,即為供試品溶液。精密稱取經(jīng)105℃干燥至恒重的無水葡萄糖適量,用水制成每1ml含56.17μg的溶液,作對照品溶液。
2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精密吸取56.17μg/ml葡萄糖對照品溶液0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.0ml,分別置于25ml比色管中,體積不足2ml者用水補(bǔ)足至2ml,以下按2.2.1“供試品溶液的制備”項(xiàng)下“分別精密加入5%的苯酚1ml”起,同法操作即得。以相應(yīng)試劑為空白,于491nm 波長處測定吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo),濃度C為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程:A = 0.0592C- 0.00113; r = 0.9997
結(jié)果表明葡萄糖在2.1064~14.0425μg/ml范圍內(nèi),線性關(guān)系良好。
2.2.3 精密度和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 用同一供試品溶液連續(xù)5次測定其吸光度和每隔1h測定一次吸光度,共測定4 次,計算出精密度實(shí)驗(yàn)的RSD%為0.22;穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD%為0.55。表明儀器精密度良好,顯色后的溶液3h內(nèi)穩(wěn)定。
2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn)和回收率試驗(yàn) 精密稱取2005年6月采收的惠水野生益母草樣品5份,每份約0.3g,按2.2.1“供試品溶液的制備”方法制備供試溶液,按2.2.2“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作”項(xiàng)下的相同測試條件進(jìn)行測定。樣品含量平均值為4.46%,RSD%為0.79。精密稱取已知多糖平均含量為4.46%的益母草供試品5份,每份約0.16g,分別精密加入濃度為0.142g/ml的葡萄糖對照品溶液50ml,以下按2.2.1“供試品溶液的制備”方法制備供試溶液,按2.2.2“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作”項(xiàng)下的相同測試條件進(jìn)行測定,結(jié)果平均回收率為98.87%,RSD%為0.71。
2.2.5 樣品含量測定 按“2.2.1” 項(xiàng)供試品溶液制備方法制備供試品溶液,用“2.2.2” “標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作”項(xiàng)下的相同測試條件對各樣品進(jìn)行多糖含量測定(含量按葡萄糖計)結(jié)果見表1。
3 討論
水蘇堿是益母草的主要藥用成分之一,而多糖雖不是益母草的主要藥用成分,但對許多疾病的輔助治療作用卻不可忽視。由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)看出,人工種植益母草中水蘇堿含量在開花前隨生長年限變化呈遞增趨勢,此時益母草中的多糖含量也相對較高。而到果期水蘇堿含量明顯下降的同時,多糖含量也明顯下降。多糖類化合物廣泛存在于植物細(xì)胞壁中,也就是說多糖的存在是水蘇堿在植物體內(nèi)合成的一種保障,果期由于植物體內(nèi)大量消耗糖分,水蘇堿的合成也相應(yīng)降低,含量也隨之降低。人工種植益母草與野生益母草相比,由于注意管理,人工種植益母草中水蘇堿和多糖含量較高,而野生益母草中卻相對較低。
從人工種植益母草中水蘇堿和多糖含量變化有一定規(guī)律來看,中藥制劑的質(zhì)量首先是原料藥材的質(zhì)量要得到保證,其質(zhì)量才可控,而野生益母草生長年限難以確定,水蘇堿和多糖含量變化也不易掌握,因此用其作為原料生產(chǎn)的復(fù)方制劑質(zhì)量也難以保證。人工種植益母草是中藥制劑質(zhì)量控制的一個發(fā)展方向,掌握其最佳采收時間,控制原料藥材的質(zhì)量,也就保證了中藥制劑質(zhì)量的穩(wěn)定。所以,益母草由野生轉(zhuǎn)為人工種植勢在必行。
【參考文獻(xiàn)】
1 范美華,王健鑫,李 鵬,等.益母草的研究進(jìn)展.中藥藥物與臨床,2006,6(7):528.
2 張嫻,彭國平.益母草屬化學(xué)成分研究進(jìn)展.天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2003,15(2):162-166.
3 劉吉成,牛英才.多糖藥物學(xué).北京: 人民衛(wèi)生出版社,2008,1.
4 吳華振.植物多糖的藥理作用及應(yīng)用進(jìn)展.實(shí)用醫(yī)技雜志, 2005,12(7):1803-1804.
5 國家藥典委員會.中國藥典(一部).北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005,203.
6 高言明,陳海云,龔 飛.中藥金櫻子不同采收期多糖的含量分析. 貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2005,27(1):57-58.
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