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體外肝代謝系統(tǒng)的研究和應(yīng)用
【摘要】 肝藥酶在藥物代謝中具有十分重要的作用。對(duì)肝藥酶的研究方法中,以動(dòng)物肝臟或肝細(xì)胞為基礎(chǔ),構(gòu)建體外肝代謝系統(tǒng)是體外代謝研究中最重要的環(huán)節(jié)之一。對(duì)體外肝代謝的研究,主要是利用肝微粒體、基因重組CYP450酶系、肝細(xì)胞培養(yǎng)、肝組織切片及離體肝灌流系統(tǒng)等方法。本文綜述近年國(guó)內(nèi)外所應(yīng)用的不同體外肝代謝系統(tǒng),并對(duì)各體外代謝研究方法進(jìn)行比較,指出根據(jù)各系統(tǒng)的特性、不同的實(shí)驗(yàn)要求和目的,選擇適當(dāng)?shù)难芯糠椒ǖ闹匾浴?
【關(guān)鍵詞】 細(xì)胞色素P450酶;肝微粒體;肝細(xì)胞培養(yǎng);肝組織切片;離體肝灌流
藥物代謝(drug metabolism)一般是指藥物的生物轉(zhuǎn)化(drug biotransformation)。藥物經(jīng)生物轉(zhuǎn)化后,可引起藥物的藥理活性或∕和毒理活性的改變。因此,研究藥物的生物轉(zhuǎn)化,明確其代謝過(guò)程,對(duì)新藥開(kāi)發(fā)、新劑型設(shè)計(jì)及制定合理的臨床用藥方案等方面都具有重要的指導(dǎo)意義。肝臟是藥物生物轉(zhuǎn)化的重要器官,含有參與藥物代謝重要的酶系(細(xì)胞色素P450酶,cytochrome P450,CYP450),該酶系參與藥物及各種內(nèi)源性和外源性化合物在體內(nèi)的代謝過(guò)程。CYP450酶系由三十多種同工酶(亞型)組成,主要有CYP1、CYP2、CYP3三大家族[1]。本文所介紹的各種體外代謝系統(tǒng)均含有一種或多種CYP450酶的同工酶,為研究藥物體外代謝提供了研究的對(duì)象和基礎(chǔ)。動(dòng)物肝體外代謝研究可以較好地排除體內(nèi)因素干擾,直接觀察酶對(duì)底物代謝的選擇性,為整體試驗(yàn)提供可靠的科學(xué)依據(jù)。以肝臟為基礎(chǔ)的體外代謝系統(tǒng)主要包括肝微粒體、基因重組CYP450酶系、肝細(xì)胞、肝組織切片及離體肝灌流。
1肝微粒體
1.1肝微粒體的制備
多數(shù)采用差速離心法[2],通過(guò)高速離心使微粒體與其他成分分離,操作簡(jiǎn)單,無(wú)需其他試劑輔助。但較耗時(shí),設(shè)備要求高,使該法的普及和深入研究受到一定的限制。針對(duì)這些情況,可采用試劑輔助分離的方法[3],在離心前額外加入一定比例的PEG6000或CaCl2,促進(jìn)微粒體沉降。此法對(duì)設(shè)備要求降低,并縮短了實(shí)驗(yàn)周期。肝微粒體的制備過(guò)程均應(yīng)在4 ℃下進(jìn)行。正確、合理地選擇緩沖液,能起到良好介質(zhì)的作用,按比例加入后進(jìn)行肝組織的破碎和勻漿,才可有效分離肝微粒體和避免細(xì)胞器受損。
1.2肝微粒體的主要應(yīng)用
1.2.1測(cè)定CYP450酶活性
測(cè)定原理是在特定酶催化下,底物在輔助因子以及適合的溫度、時(shí)間作用下反應(yīng),借助儀器測(cè)定生成的特定產(chǎn)物量。由于反應(yīng)可控和周期短,目前大多數(shù)P450酶以肝微粒體作為反應(yīng)體系進(jìn)行酶活性的測(cè)定[2]。各種酶活性測(cè)定的步驟基本相同,差別主要在于酶對(duì)應(yīng)的底物和檢測(cè)儀器的選擇。一般以底物及代謝途經(jīng)來(lái)命名各種酶,如7乙氧基試鹵靈O脫乙基酶(CYP 1A1)[4]、氯唑沙宗羥化酶(CYP 2E1)[5]等。根據(jù)底物特性選擇檢測(cè)儀器,常用的有紫外∕熒光分光光度計(jì),或聯(lián)用HPLC系統(tǒng)。
1.2.2考察藥物對(duì)肝藥酶活性的影響
某些藥物在體內(nèi)不同程度地誘導(dǎo)或抑制肝藥酶活性,這將影響到同時(shí)服用的其他藥物的代謝,如抑制CYP 3A活性的藥物(如紅霉素等),若與其他經(jīng)這一家族酶代謝的藥物(如西尼地平等)同時(shí)服用,則可能減慢其代謝,從而增強(qiáng)藥效或毒副作用[6]。近年來(lái),關(guān)于考察中藥成分對(duì)肝藥酶活性影響的報(bào)道增多,從體外分子水平來(lái)評(píng)價(jià)它們對(duì)肝代謝的影響,可為中藥配伍提供依據(jù)。如代方國(guó)等[7]考察給以甘草、甘遂、甘遂甘草配伍藥液的大鼠的肝微粒體中CYP 2E1的活性,發(fā)現(xiàn)甘草組和配伍組對(duì)CYP 2E1活性的誘導(dǎo)作用顯著高于甘遂組;甘遂可能通過(guò)誘導(dǎo)肝臟CYP2E1的表達(dá)與活性上升;甘遂甘草配伍使用時(shí),甘草對(duì)CYP2E1活性的誘導(dǎo)能力更強(qiáng),故兩者配伍時(shí),可促進(jìn)甘遂所含前致癌物質(zhì)和前毒物轉(zhuǎn)化成為致癌物和毒物的過(guò)程,并導(dǎo)致對(duì)機(jī)體毒性作用的增強(qiáng)。
1.2.3進(jìn)行藥物體外代謝途徑研究
將藥物加入肝微粒體中進(jìn)行孵育后,利用質(zhì)譜檢測(cè)離子碎片來(lái)鑒定代謝物的結(jié)構(gòu),包括藥物不同位點(diǎn)上的羥化物或去烷基產(chǎn)物,從而確定代謝途徑。有報(bào)道指出[8],新型抗焦慮藥AF5加入人肝微粒體中進(jìn)行孵育,經(jīng)GCMS分析,鑒定出兩種主要代謝產(chǎn)物:4羥基AF5(Ⅰ)及4羰基AF5(Ⅱ)。AF5在肝微粒體中代謝的主要產(chǎn)物為Ⅰ,Ⅰ在人肝微粒體中,可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為Ⅱ,后者不再被代謝。
1.2.4考察手性藥物的代謝立體選擇性
周權(quán)等[9]把手性藥物與大鼠肝微粒體相結(jié)合,對(duì)其立體選擇性代謝作了詳細(xì)的考察。作者把R/S普羅帕酮(propafenone,PPF)加入經(jīng)地塞米松或β萘黃酮誘導(dǎo)的大鼠肝微粒體中孵育,經(jīng)提取及手性拆分后,進(jìn)入HPLC系統(tǒng)分析。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,在經(jīng)誘導(dǎo)的肝微粒體中,PPF的Ⅰ相代謝呈顯著的立體選擇性。
總之,改進(jìn)后的體外肝微粒體法耗時(shí)少,重現(xiàn)性好,易大量操作。適用于酶活性及體外代謝清除等方面的研究,在實(shí)際工作中應(yīng)用較廣。但同其他體外肝代謝方法相比,需要的原材料較多,且與體內(nèi)情況的一致性方面存在不足,因而其結(jié)果是否有利預(yù)測(cè)體內(nèi)情況仍需進(jìn)一步研究。
2基因重組人肝微粒體CYP450酶系
利用基因工程及細(xì)胞工程,將調(diào)控CYP450酶系表達(dá)的基因整合到大腸桿菌或昆蟲(chóng)細(xì)胞,再經(jīng)培養(yǎng)可表達(dá)高水平的CYP450酶系,純化后還可獲得較單一的CYP450同工酶。在明確某些藥物經(jīng)特定酶代謝后,即以此酶進(jìn)行單一代謝,更準(zhǔn)確地觀察代謝結(jié)果,避免受其他酶共同參與此代謝途徑的干擾。Ching等[10]通過(guò)在酵母中克隆方法,得到高表達(dá)的人CYP 1A1和CYP 1A2,用于測(cè)定普萘洛爾對(duì)映體的去烴基化和環(huán)羥化反應(yīng)的立體選擇性和酶動(dòng)力學(xué)參數(shù),明確了CYP 1A2均參與了2種途徑,但CYP 1A1只參與了去烴化反應(yīng)。有學(xué)者進(jìn)一步運(yùn)用重組人肝微粒體,應(yīng)用酶抑制劑對(duì)普萘洛爾對(duì)映體的代謝途徑進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)[11-13]。其中Yoshimoto等[12] 應(yīng)用基因重組的及人肝微粒體中的CYP酶系同工酶進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)α萘黃酮對(duì)普萘洛爾R/S對(duì)映體的N脫異丙基化(desisopropylation)抑制作用分別為20%和40%;奎尼丁對(duì)其2種對(duì)映體的4環(huán)羥化代謝的抑制作用較完全;而其他酶抑制劑對(duì)其對(duì)映體的影響較小。
基因重組CYP450酶系與前述的肝微粒體在研究藥物代謝方面具有一定的相關(guān)性。但前者在藥酶誘導(dǎo)特異性和選擇性研究上優(yōu)于其他的體外方法,并可在分子水平上,為藥物與酶在結(jié)合位點(diǎn)的相互作用研究提供更多的信息。盡管該方法先進(jìn)性較為突出,但由于受到設(shè)備條件和技術(shù)的限制,通過(guò)基因工程獲得的酶量與種類仍較有限,純化程度有待進(jìn)一步提高,故其作為研究代謝的體外系統(tǒng)的地位仍有待進(jìn)一步提高。
3肝細(xì)胞培養(yǎng)
3.1體外培養(yǎng)技術(shù)與細(xì)胞活性的維持
體外培養(yǎng)包括肝細(xì)胞株的培養(yǎng)和原代肝細(xì)胞的分離與培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞來(lái)源于不同,經(jīng)重復(fù)篩選可制備出不同型號(hào)的肝細(xì)胞株,滿足各種實(shí)驗(yàn)需要。肝細(xì)胞株容易貼壁存活,在相對(duì)穩(wěn)定的培養(yǎng)條件下,傳20~30代不會(huì)出現(xiàn)明顯衰老現(xiàn)象。原代細(xì)胞需經(jīng)過(guò)從器官中分離的過(guò)程,存在分離難度大、體外培養(yǎng)要求條件高、存活時(shí)間短、增殖及傳代困難等問(wèn)題。多數(shù)研究者采用改良的Seglen兩步膠原酶灌注法。但此法操作繁瑣,設(shè)備及實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求高,影響因素較多[14],包括灌注液的種類和速度、肝臟灌洗是否充分、分離消化的酶、培養(yǎng)液的組成和肝細(xì)胞懸液的離心清洗等。鑒于上述原因,劉友平[15]等采用肝組織塊貼壁法原代培養(yǎng),即只把組織塊剪碎,不用膠原酶消化,直接按肝細(xì)胞的培養(yǎng)方法進(jìn)行貼壁培養(yǎng),在傳代時(shí)加胰酶消化,只取上層細(xì)胞懸液繼續(xù)培養(yǎng)。該法簡(jiǎn)單快捷,無(wú)需灌注、離心,所得肝細(xì)胞活力高。
為了解決肝細(xì)胞活性體外維持時(shí)間短的問(wèn)題, Hengstler[16]等研究?jī)?yōu)化肝細(xì)胞冷凍技術(shù)。同新鮮肝細(xì)胞相比,經(jīng)過(guò)該技術(shù)冷凍儲(chǔ)藏的肝細(xì)胞活性為新鮮肝細(xì)胞的80%以上,而其Ⅰ相、Ⅱ相代謝酶的活性>60%,可用于反應(yīng)時(shí)間不超過(guò)8h的代謝研究,亦可用于藥酶的誘導(dǎo)研究,但該技術(shù)仍需進(jìn)一步優(yōu)化。
3.2肝細(xì)胞培養(yǎng)的主要應(yīng)用
3.2.1進(jìn)行藥物體外代謝途徑與體內(nèi)相關(guān)性研究
Nakagawa等[17] 將BPA[2,2bis(4hydroxyphenyl)propane,2,2雙(4羥苯基)丙烷]加于大鼠肝細(xì)胞中,經(jīng)質(zhì)譜檢測(cè),BPA很快代謝為單葡萄糖醛酸結(jié)合物及2個(gè)次要代謝物(單硫酸結(jié)合物和3OHBPA)。在BPA體內(nèi)代謝研究中發(fā)現(xiàn),約20%~30%的BPA從尿中排泄,主要為首過(guò)效應(yīng)中生成的葡萄糖醛酸結(jié)合物,其中硫酸結(jié)合物占尿液中總代謝物的2%~3%[18]。因此BPA肝細(xì)胞體外溫孵與體內(nèi)過(guò)程很相似,具有一定的代表性。
3.2.2進(jìn)行藥物體外代謝清除研究
Shibata[19]等人運(yùn)用冷藏保存的人肝細(xì)胞混懸于100%的人血漿中,將預(yù)測(cè)的肝利用度及清除率與14種臨床常用的藥物的生物利用度和血漿清除率進(jìn)行比較時(shí),發(fā)現(xiàn)不同的細(xì)胞來(lái)源,內(nèi)在清除率存在極大的個(gè)體差異性。同時(shí)在基礎(chǔ)的生物定標(biāo)系數(shù)(3.1×109 個(gè)/kg)下,用外推法將體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的預(yù)測(cè),往往會(huì)出現(xiàn)明顯的偏低現(xiàn)象,因此計(jì)算的定標(biāo)系數(shù)應(yīng)比基礎(chǔ)生物大3~5倍。為獲得更可靠的定量預(yù)測(cè)結(jié)果,通過(guò)預(yù)試驗(yàn)來(lái)確定校正的定標(biāo)系數(shù)是至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。
由于在新鮮分離的肝細(xì)胞中,介導(dǎo)藥物代謝的CYP450酶系存在時(shí)間依賴性衰減的現(xiàn)象,所以一般的肝細(xì)胞培養(yǎng)都要求在肝細(xì)胞生存時(shí)間跨度內(nèi)進(jìn)行。Griffin和Houston [20]對(duì)體外單層肝細(xì)胞培養(yǎng)的內(nèi)在清除能力(CLint)與新鮮游離肝細(xì)胞懸液的清除能力進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)其內(nèi)在的清除能力與代謝速度有關(guān),單層肝細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)更適合于代謝速度慢的藥物。
總之,用肝細(xì)胞培養(yǎng)方法作為評(píng)價(jià)藥物代謝的體外系統(tǒng),存在一定的偏差。其結(jié)果與體內(nèi)的情況相近程度,很大程度上取決于研究者的經(jīng)驗(yàn)。
3.2.3參與新型多器官共培養(yǎng)
的研究
在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi),研究者都只是單純考察藥物代謝在某一種器官(如肝臟)中的作用情況。而實(shí)際上,藥物在體內(nèi)的過(guò)程是多因素綜合作用的。根據(jù)最新報(bào)道[21], 肝細(xì)胞參與整體非連續(xù)性多器官共培養(yǎng)體系(IdMOC),即把肝細(xì)胞和來(lái)自于其他多個(gè)器官的非肝原代細(xì)胞一起培養(yǎng),為在藥物代謝和毒副效應(yīng)方面評(píng)價(jià)多器官之間的相互作用提供可能性。
肝細(xì)胞同肝微粒體相比,在代謝物生成、體外代謝清除等研究方面有許多相似性,但針對(duì)代謝物種類、主要代謝物及所反映的代謝特性上存在著質(zhì)或量的差異。隨著肝細(xì)胞冷凍技術(shù)的發(fā)展,因其體外活性維持時(shí)間短而造成的應(yīng)用限制會(huì)不斷得到改善。
4肝組織切片
在各種器官組織切片中以肝切片的應(yīng)用最多,可在較長(zhǎng)的孵育時(shí)間內(nèi)保持代謝活性。據(jù)報(bào)道,小鼠肝切片可培育3~5 d[22]。組織切片的實(shí)驗(yàn)與培育條件使得其重現(xiàn)性比灌注器官的重現(xiàn)性容易得多。切片制備相對(duì)快捷而簡(jiǎn)便。但其缺點(diǎn)為切片機(jī)的大量使用受限,而且價(jià)格昂貴。De Kanter[23]等利用利多卡因、睪酮及7乙氧基香豆素為探針?biāo)幬?進(jìn)行了器官切片實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,該系統(tǒng)具有多相代謝途徑,且易于比較不同器官組織的代謝差別。研究發(fā)現(xiàn)不同種屬及不同器官間代謝類型及速度不同。
Vickers[24]用肝組織切片研究環(huán)孢素A(CSA)的代謝,CSA本身是CYP3A4的底物,但在人肝切片中加入1~10 mol/L CSA培育24 h,使CYP3A4活性降低了25%,說(shuō)明在CSA高濃度時(shí)可減少本身的清除率而提高血藥濃度。若用某些疾病的標(biāo)記物加入肝組織切片中培育,也可研究藥物的不良反應(yīng)如對(duì)肝的損害(以GSP或核基質(zhì)蛋白Numa為標(biāo)記物)或?qū)χ|(zhì)代謝的影響(以Lp(a)為標(biāo)記物)等。
組織切片完整地保留了所有的肝藥酶及細(xì)胞器的活性,而且保留了一定的細(xì)胞間質(zhì)。這些特點(diǎn)相比于分子水平和細(xì)胞水平,更具宏觀性與整體性,更能反映藥物在體內(nèi)生理情況下的實(shí)際代謝過(guò)程,為分子理論與離體器官之間,乃至臨床應(yīng)用架起了橋梁。
5離體肝灌流
5.1肝臟灌注的特點(diǎn)
肝臟灌流技術(shù)作為一種與在體肝臟最具可比性的體外系統(tǒng),有其突出的優(yōu)點(diǎn) 是可以在接近生理狀況的條件下進(jìn)行肝功能研究,保持完整細(xì)胞的天然屏障和營(yíng)養(yǎng)液的供給,能排除其他組織、臟器的干擾及便于動(dòng)態(tài)定量分析受試物及其代謝產(chǎn)物。因而離體器官灌注處于體內(nèi)與體外的臨界點(diǎn)。然而肝臟灌流技術(shù)亦存在缺陷,如受時(shí)間的限制、易受其他因素的干擾(如手術(shù)操作、灌流液組成、流速等),手術(shù)及插管操作技術(shù)極復(fù)雜。
5.2離體肝灌流的主要應(yīng)用
5.2.1持續(xù)考察藥物代謝
利用離體肝的生理活性進(jìn)行持續(xù)性的藥物代謝考察及某些生命物質(zhì)與藥物之間的相互作用,以此有效預(yù)測(cè)體內(nèi)-體外的相關(guān)性。Wang等[25]運(yùn)用大鼠肝灌流,測(cè)定美托洛爾的Vmax和KM、代謝物的增加量和氨基酸的減少量,以此考察氨基酸對(duì)美托洛爾的抑制作用。結(jié)果顯示:氨基酸可逆地減少了母藥及代謝物的Vmax約50%,而對(duì)KM則影響不明顯。氨基酸可能直接抑制了代謝美托洛爾的酶。因此估計(jì)多種類似代謝機(jī)制可有效影響人體內(nèi)食物與高首過(guò)效應(yīng)的藥物。應(yīng)用離體肝臟灌注,定性和定量檢測(cè)灌流液中的母體藥物及代謝產(chǎn)物濃度,可了解受試化學(xué)物質(zhì)在肝臟內(nèi)所發(fā)生的代謝變化及反應(yīng)類型。
5.2.2藥物首過(guò)效應(yīng)的研究
首過(guò)效應(yīng)明顯的藥物,生物利用度低,這在臨床合理用藥中受到重視。在藥物研究過(guò)程中,應(yīng)用分離肝細(xì)胞、肝勻漿、肝微粒體等體外方法雖可揭示藥物肝臟代謝的機(jī)制和相關(guān)代謝酶系,但不能提供關(guān)于體內(nèi)首過(guò)代謝程度的信息。Lau等[26]利用離體灌注大鼠肝模型,研究利福平對(duì)阿托伐他汀及其代謝物的生物轉(zhuǎn)化的影響,認(rèn)為口服阿托伐他汀生物利用度極低與首過(guò)效應(yīng)有關(guān),尤其是存在明顯的腸道首過(guò)效應(yīng)。
5.2.3藥物相互作用的研究
Lucas[27]等應(yīng)用一過(guò)式離體大鼠肝臟灌流模型研究了植物雌激素異黃酮對(duì)硫酸干擾乙酰氨基酚在肝臟形成及處置的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)l0 μmol的異黃酮混合物能減少硫酸對(duì)乙酰氨基酚的形成,減少對(duì)乙酰氨基酚的肝清除。
6結(jié) 語(yǔ)
肝體外代謝系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于藥物代謝研究的各個(gè)方面,在不同研究背景下互相補(bǔ)足。肝微粒體代謝快,易大量操作,近年來(lái)在大量文獻(xiàn)中用于酶活性及體外代謝清除等方面的研究,在實(shí)際工作中應(yīng)用較廣�；蛑亟MCYP450酶系在分子水平上的“單一性”為深入研究藥酶誘導(dǎo)的“特異性”和“選擇性”提供了技術(shù)支持。肝細(xì)胞所保持的完整微觀結(jié)構(gòu),針對(duì)代謝特性及多種細(xì)胞共同作用等方面,均有較好的研究空間。而組織切片所保留的細(xì)胞器和細(xì)胞間質(zhì),以及離體肝灌注所保持的正常生理活性,可更全面地在“體外”這個(gè)層面上,為前3種微結(jié)構(gòu)系統(tǒng)與體內(nèi)一致性方面所存在的不足進(jìn)行補(bǔ)充和完善。因此,根據(jù)各系統(tǒng)的特性,不同的要求和目的,分別選擇應(yīng)用,才能正確解釋實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,才能更好地接近臨床實(shí)踐。
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