細(xì)胞凋亡與肝臟疾病

細(xì)胞凋亡與肝臟疾病[關(guān)鍵詞] 細(xì)胞 肝臟疾病

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 劉增權(quán) 　李孝生 400010重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科   　　自從1972年病理學(xué)家Kerr首先對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行描述以來(lái)，經(jīng)過(guò)20余年的研究，人們認(rèn)識(shí)到細(xì)胞凋亡在組織的自動(dòng)平衡中起著重要作用。細(xì)胞凋亡是通過(guò)正常的方式在多細(xì)胞生物中消除不需要的、衰老的和受損的細(xì)胞，使機(jī)體細(xì)胞有絲分裂的速度與凋亡的速度相平衡。任何情況的異常凋亡對(duì)機(jī)體都是有害的，都會(huì)產(chǎn)生不良后果，肝臟也不例外。目前人們認(rèn)識(shí)到異常凋亡在肝病的發(fā)生、發(fā)展起著重要作用:一方面，肝細(xì)胞過(guò)度凋亡可以導(dǎo)致嚴(yán)重的肝臟損傷;另一方面，誘導(dǎo)凋亡機(jī)制的喪失可以導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。因此，對(duì)肝病患者需抑制肝細(xì)胞的凋亡，對(duì)肝癌患者需選擇性的誘導(dǎo)肝細(xì)胞的凋亡。    1 細(xì)胞凋亡的定義和檢測(cè)方法    1.1 定義 細(xì)胞凋亡是一個(gè)主動(dòng)過(guò)程，是機(jī)體在生理或病理?xiàng)l件下受到刺激后，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生一系列形態(tài)和生化方面的改變而引起的程序性細(xì)胞死亡（programmed cell death，PCD）。細(xì)胞凋亡的特點(diǎn):（1）細(xì)胞變小，核固縮，細(xì)胞膜完整。（2）核碎裂，DNA斷裂成180～200bp，而且有蛋白質(zhì)和mRNA的合成。（3）膜包繞的凋亡小體形成（在肝細(xì)胞稱為Councilman小體）。（4）凋亡小體被鄰近巨噬細(xì)胞吞噬，這整個(gè)過(guò)程進(jìn)展非常快，由數(shù)分鐘到幾個(gè)小時(shí) ［1］  。（5）一般周圍無(wú)炎癥反應(yīng)，但如果凋亡速度大于清除速度，則組織結(jié)構(gòu)被破壞而且伴隨炎癥反應(yīng) ［2］  。與凋亡不同，壞死是一個(gè)被動(dòng)過(guò)程，壞死細(xì)胞變大，核溶解，膜通透性改變，線粒體結(jié)構(gòu)變化，DNA隨機(jī)斷裂，其間沒有蛋白質(zhì)和mRNA的合成，壞死周圍有炎癥反應(yīng)。    1.2 檢查方法 （1）對(duì)細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的觀察有HE染色光鏡觀察以及電子顯微鏡、相差顯微鏡、共聚焦激光掃描顯微鏡檢查。（2）對(duì)DNA降解片段的分析有瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA以及Southern Blotting方法。（3）熒光標(biāo)記膜蛋白V的檢測(cè) ［3］  。（4）流式細(xì)胞技術(shù)（FCM）可以對(duì)活體或已固定的凋亡細(xì)胞進(jìn)行定量分析。（5）末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧尿苷三磷酸缺口末端標(biāo)記術(shù)（TUNEL）。（6）免疫組化。    2 凋亡機(jī)制    細(xì)胞凋亡的生化特點(diǎn)包括質(zhì)膜磷脂排列方向改變、細(xì)胞內(nèi)離子環(huán)境自穩(wěn)改變、蛋白酶和核酸內(nèi)切酶激活分別致細(xì)胞蛋白質(zhì)裂解和DNA斷裂、細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生神經(jīng)酰胺（ceˉramide）、線粒體功能障礙、谷胱甘肽耗竭以及轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（transglutaminase）激活 ［1，4］  。    參與引發(fā)細(xì)胞凋亡的蛋白酶有多種，包括半胱氨酰天門冬氨酸特異蛋白酶（CASPSE，cysteingylaspartase specific proˉtease）家族成員和組織蛋白酶等 ［5］  。特別是caspase家族成員與細(xì)胞凋亡關(guān)系最為密切，至少有14種哺乳動(dòng)物caspase已獲克隆，但僅對(duì)caspase-3和caspase-8的功能有所了解。caspase-8在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮啟動(dòng)作用;caspase-3在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮效應(yīng)作用 ［6］  。由于各caspase可相互激活，所以caspase蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)（caspase protease cascade）是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡結(jié)構(gòu)改變的主要環(huán)節(jié)。線粒體功能障礙在細(xì)胞凋亡發(fā)生機(jī)制中起關(guān)鍵作用 ［6］  ，能促進(jìn)線粒體功能障礙的因素很多，包括各種有害刺激和信號(hào)傳遞過(guò)程，其中某些配體/受體相互作用最為重要。配體與靶細(xì)胞表面受體相結(jié)合，就導(dǎo)致復(fù)雜的多蛋白復(fù)合物（multiprotein complex）形成，即將凋亡信號(hào)傳遞給效應(yīng)蛋白酶FLICE（Fas-associated proˉtein like interleukin-1βconverting enzyme，F(xiàn)as相關(guān)性蛋白樣白細(xì)胞介素1β轉(zhuǎn)化酶），F(xiàn)LICE與caspase-8相互反應(yīng)可激活caspase-8，caspase-8激活后就通過(guò)某些不明的機(jī)制引發(fā)線粒體功能障礙。線粒體功能障礙導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放，細(xì)胞色素C與凋亡激活因子-2（apoptosis activating factor-2，Apaf-2）相結(jié)合，使caspase-3激活 ［7］  。caspase-3又激活DNA斷裂因子（DNA fragmentation factor），導(dǎo)致靜息狀態(tài)的核酸內(nèi)切酶激活，最終引起DNA斷裂。從線粒體功能障礙到DNA斷裂，是細(xì)胞凋亡生化途徑的共同途徑。    在肝細(xì)胞凋亡發(fā)生機(jī)制中，以Fas配體/Fas受體引發(fā)凋亡信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)研究得最多。此外，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）及其受體（TGF-β1R） ［8］  、腫瘤壞死因子（TNF）及其受體（TNFR） ［9］  在肝細(xì)胞凋亡發(fā)生機(jī)制中均起重要作用。細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）釋放的穿孔素（perforin）和顆粒酶B也是介導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的重要因素。    DNA斷裂分兩型。首先發(fā)生的DNA斷裂片段較大，為300kbp或500kbp的倍數(shù)，此型DNA斷裂在細(xì)胞凋亡中發(fā)生頻繁，但并非都有。繼之DNA在核小體（nucleosome）間斷裂成許多100～200bp的小片斷，或呈100～200bp的倍數(shù)出現(xiàn)，稱為DNA斷裂梯狀模式（ladderpattern） ［10］  。兩型DNA斷裂是由不同的核酸內(nèi)切酶切割而形成的。也有人認(rèn)為這兩型DNA斷裂可能單純代表一種動(dòng)力學(xué)現(xiàn)象，即必須先有足夠大的DNA片段形成，方可發(fā)生小分子DNA斷裂，用凝膠電泳技術(shù)、原位細(xì)胞化學(xué)技術(shù)或原位組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)DNA斷裂，是確定細(xì)胞凋亡的常用方法。    細(xì)胞凋亡的主要調(diào)節(jié)因子是B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2蛋白（B-cell lymphoma/leukemia-2protein，Bcl-2）家族的成員 ［11，12］  。Bcl-2，通過(guò)抑制凋亡以延長(zhǎng)細(xì)胞存活時(shí)間，是哺乳類動(dòng)物細(xì)胞凋亡的一種強(qiáng)大抑制因子。與Bcl-2關(guān)系密切的同源物是Bcl-x，有兩個(gè)RNA拼接變種，長(zhǎng)Bcl-X（Bcl-XL）是較大的拼接變種，短Bcl-X（Bcl-XS）是短拼接變種。此外還發(fā)現(xiàn)一些其它的Bcl-2同源物。Bcl-2蛋白家族細(xì)胞凋亡抑制因子有:Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W、Bcl-XS、Mcl-1、Bfl-1、Brag-1、Al;細(xì)胞凋亡促進(jìn)因子有:Bax、Bak、Bag、Bid、Bad、Hrk、Bik。    細(xì)胞凋亡促進(jìn)因子和細(xì)胞凋亡抑制因子的相對(duì)優(yōu)勢(shì)決定著細(xì)胞對(duì)致凋亡刺激的反應(yīng)性。Bcl-2及其同源物主要定位于細(xì)胞膜，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、核外膜和線粒體外膜。當(dāng)細(xì)胞接受凋亡刺激時(shí)，Bcl-2可能通過(guò)防止線粒體功能障礙或阻斷線粒體細(xì)胞色素C、Apaf-2釋放而抑制細(xì)胞凋亡。Bcl-XL似乎在不表達(dá)Bcl-2的肝細(xì)胞承擔(dān)這一功能。Bcl-2家族成員的表達(dá)在肝臟病和膽管細(xì)胞癌的發(fā)生中可能起重要作用，并參與調(diào)控肝再生反應(yīng)�！　�3 肝臟疾病中的凋亡現(xiàn)象    近年來(lái)研究表明肝細(xì)胞的死亡方式包括壞死和凋亡兩種。凋亡在肝臟疾病發(fā)展過(guò)程中的重要作用得到了人們的重視，現(xiàn)將有代表性的幾種肝臟疾病中的凋亡現(xiàn)象分述如下。　　3.1 病毒性肝炎 Fas系統(tǒng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在肝炎發(fā)生 發(fā)展過(guò)程中起著重要作用，在不同條件下，穿孔素、顆粒酶、TNF-α、TGF-β等也參與了肝細(xì)胞的凋亡 ［13，14］  。1998年Galle等 ［15］  報(bào)道乙型肝炎時(shí)肝細(xì)胞Fas表達(dá)增強(qiáng)，致敏的細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）表達(dá)Fas配基（FasL），CTL經(jīng)過(guò)免疫途徑介導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，參與病毒的清理和肝炎的病理生理過(guò)程。若該反應(yīng)過(guò)強(qiáng)，則可能誘發(fā)暴發(fā)性肝功能衰竭。這已經(jīng)得到大家的公認(rèn)。    3.2 肝纖維化 肝纖維化是慢性肝病共有的病理改變，有研究表明各種類型的肝纖維化中都存在凋亡。肝星狀細(xì)胞（HSC）的激活是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。1998年Gong等報(bào)道HSC向肌成纖維細(xì)胞（MFB）的轉(zhuǎn)變與sFasL介導(dǎo)的凋亡增強(qiáng)相平行，Bcl-2和Bcl-XL在早期HSC上的表達(dá)高于晚期HSC和MFB，Bax則相反。這說(shuō)明調(diào)節(jié)HSC的凋亡易感性在肝纖維化發(fā)生機(jī)制中起重要作用。故認(rèn)為促進(jìn)HSC的凋亡有可能成為抗纖維化的措施之一。    3.3 肝硬變 凋亡現(xiàn)象在肝硬變病例的肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞、單核細(xì)胞中普遍存在。1999年Frommel等 ［16］  對(duì)照研究了正常肝組織、丙型肝炎和肝硬變標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)對(duì)Bcl-2的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，肝硬變患者中表達(dá)最強(qiáng)，提出了一種解釋肝硬變患者中肝癌高發(fā)生率的新機(jī)制。    3.4 肝癌 肝細(xì)胞癌形成過(guò)程中，不僅癌細(xì)胞異常增生，而且突變的細(xì)胞凋亡減少，肝癌細(xì)胞對(duì)凋亡誘導(dǎo)反應(yīng)明顯缺陷 ［17］  ，1998年Jodo等報(bào)道肝癌血清中sFas水平升高，切除腫瘤后，sFas水平即下降。一些抑癌劑如:硒、類維生素A、化療藥物等可促進(jìn)鼠肝的潛在惡性細(xì)胞的凋亡，從而降低肝癌的發(fā)病率，這從一個(gè)側(cè)面反映了凋亡在肝癌發(fā)病機(jī)制中的地位。1997年Cras L等報(bào)道在非基因毒性致癌物nafenopin所致的原發(fā)性肝癌中，正常肝細(xì)胞和肝腫瘤細(xì)胞都會(huì)受到抑制。當(dāng)nafenopin的作用消失后，二者的凋亡都增加。后者的增殖率和凋亡率都高于前者。因此，采取促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡的措施，將有可能成為未來(lái)治療肝癌的有效手段之一。    3.5 酒精性肝病 凋亡可發(fā)生在臨床和實(shí)驗(yàn)性的酒精性肝病中，酒精誘導(dǎo)肝細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的機(jī)制有:（1）表達(dá)細(xì)胞色素P 450  2E 1 的HepG 2 細(xì)胞暴露于花生四烯酸導(dǎo)致了脂質(zhì)過(guò)氧化和凋亡增加;（2）肝鐵水平的升高也促進(jìn)了脂質(zhì)過(guò)氧化和肝細(xì)胞凋亡發(fā)生;（3）酒精性肝病中TNF及其受體的水平都升高，二者結(jié)合導(dǎo)致凋亡增加;（4）肝細(xì)胞CD95L的水平升高與肝組織中的CD95結(jié)合誘導(dǎo)凋亡;（5）CTL細(xì)胞也通過(guò)CD95與CD95L的結(jié)合促進(jìn)凋亡的發(fā)生。    3.6 自身免疫性肝病 細(xì)胞凋亡對(duì)于清除潛在的自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞以及免疫應(yīng)答后剩余的效應(yīng)細(xì)胞或突變細(xì)胞 具有重要意義。若該機(jī)制發(fā)生障礙，則可能導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生。自身免疫性肝病中具有代表性的是原發(fā)性膽汁性肝硬變（PBC），它是一種免疫介導(dǎo)的肝內(nèi)小膽管進(jìn)行性損害為特征的自身免疫病。1997年Harada等報(bào)道 ［18］   PBC受損膽管上皮細(xì)胞高表達(dá)CD95L，CD95/CD95L途徑的凋亡導(dǎo)致了膽管上皮細(xì)胞的破壞。    總之，細(xì)胞凋亡在某些肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸中可能起著重要的作用，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實(shí)�！　�參考文獻(xiàn)    1 Fraser A，Evan G.A license to kill.Cell，1996，85:781.2 Feldmann G.Liver apoptosis.J Hepatol，1997，26:1.    3 Van EnglishM，Nieland LJ，Ramaejers FC，et al.Annexin V-affinity assay:A review on an apoptosis detection system based on 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