人乳頭瘤病毒（HPV）疫苗的研究進(jìn)展

人乳頭瘤病毒（HPV）疫苗的研究進(jìn)展[關(guān)鍵詞] 宮頸癌

健康網(wǎng)訊:

  　李 娟　 王佑春     　宮頸癌是嚴(yán)重危害婦女健康和生命的疾病，每年約有50萬(wàn)新發(fā)病例，25萬(wàn)人死亡，是引起婦女死亡的第二大原因，其中大部分在發(fā)展中國(guó)家，占80%左右 ［1］  。1977年德國(guó)學(xué)者Zur Hausen等從宮頸癌標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)了人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）DNA，推測(cè)HPV感染與宮頸癌發(fā)生有關(guān)。進(jìn)一步的分子流行病學(xué)證據(jù)表明，HPV與人類(lèi)多種癌癥，特別是與宮頸癌有著密切的關(guān)系。由國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）組織在22個(gè)國(guó)家進(jìn)行了針對(duì)引起侵襲性宮頸癌（ICC）的HPV類(lèi)型的調(diào)查 ［2］  。組織學(xué)確診為ICC的1000個(gè)病例中有99.7%發(fā)現(xiàn)HPV DNA陽(yáng)性，其上HPV的類(lèi)型主要為HPV16（53%）和HPV18（15%）。　　1 機(jī)體對(duì)HPV感染的免疫反應(yīng)    HPV屬乳頭多瘤空泡病毒科（Papovaviridae）乳頭瘤病毒屬，是一類(lèi)感染表皮和粘膜鱗狀上皮的小DNA病毒。其基因組為雙鏈環(huán)狀DNA，長(zhǎng)7.5～8.0kb，含8個(gè)開(kāi)放閱讀框（open reading frames，ORFs），依功能不同分3個(gè)區(qū):（1）早期區(qū)（early region，E區(qū)）:分別編碼E1、E2、E4、E5、E6、E7等六個(gè)早期蛋白，參與病毒DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯調(diào)控和轉(zhuǎn)化等功能。（2）晚期區(qū)（late region，L區(qū)）:編碼主要外殼蛋白L1和次要外殼蛋白L2。（3）非編碼區(qū)（uncoding region，UCR）或上游調(diào)控區(qū)（URR）:含有HPV基因組DNA的復(fù)制起點(diǎn)和HPV表達(dá)所必需的調(diào)控元件。    按照HPV感染與宮頸癌發(fā)生的危險(xiǎn)性，將HPV分為低危型（HPV1，6，11等）和高危型（HPV16，18，31，45等）。低危型HPV主要引起表皮細(xì)胞良性增生，如HPV6和11型可引起生殖器疣和兒童復(fù)發(fā)性乳頭瘤。高危型HPV與宮頸上皮內(nèi)瘤的發(fā)生和惡變以及其他上皮性腫瘤的發(fā)生相關(guān)。HPV感染在人群中較為普通，大部分人在性生活開(kāi)始后，都感染過(guò)該病毒。病毒通過(guò)受損的上皮組織進(jìn)入基底層細(xì)胞，其復(fù)制周期受?chē)?yán)格的調(diào)節(jié)，并依賴于病毒編碼的蛋白質(zhì)和宿主上皮細(xì)胞的分化程度。病毒感染通常為局部限制性，不引起炎癥反應(yīng)。大多數(shù)人都能自行清除病毒，只有一小部分人由于免疫系統(tǒng)的原因無(wú)法清除病毒，造成HPV持續(xù)存在，繼而發(fā)展為宮頸癌。    許多證據(jù)表明HPV感染能激發(fā)宿主免疫反應(yīng)，如大多數(shù)皮膚疣兩年內(nèi)可自發(fā)消退，且多處感染灶同時(shí)消退 ［3］  。大多數(shù)人在性生活開(kāi)始后，都感染過(guò)HPV，隨后感染率降低，說(shuō)明免疫系統(tǒng)可以清除病毒并長(zhǎng)期產(chǎn)生保護(hù)作用。HPV中和抗體可以保護(hù)機(jī)體免受病毒的感染，但對(duì)已經(jīng)存在的病毒，則需要細(xì)胞免疫來(lái)清除已感染的細(xì)胞。在宮頸損傷病人的消退過(guò)程中大多可檢測(cè)到細(xì)胞免疫反應(yīng)的升高 ［4］  ;而免疫抑制如器官移植時(shí)，病人患疣的機(jī)率增大;HIV病人比健康人患尖銳濕疣的機(jī)率高2～7倍;由此可見(jiàn)，細(xì)胞介導(dǎo)的免疫機(jī)制對(duì)于控制HPV感染有重要的作用。    2 HPV疫苗研究現(xiàn)狀      　　由于從感染灶組織中很難分離到病毒體，迄今未能建立體外培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行病毒培養(yǎng)。目前對(duì)宮頸癌的治療基本以手術(shù)和放療為主，給病人帶來(lái)很大的痛苦。預(yù)防HPV相關(guān)癌癥的最有效的方法是研制特異性的疫苗，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，激發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)，達(dá)到有效預(yù)防與癌癥相關(guān)型的HPV傳播的目的，降低宮頸癌的發(fā)生率，并且可能降低與HPV感染弱相關(guān)的癌癥如肛門(mén)、外陰或扁桃體癌的發(fā)生率。由于E6、E7蛋白具有轉(zhuǎn)化活性，使用全病毒做疫苗有致癌的危險(xiǎn)，因此，目前的研制方向主要集中在亞單位疫苗方面。根據(jù)其功能不同，疫苗分為預(yù)防性疫苗和治療性疫苗。預(yù)防性疫苗多以HPV的主要衣殼蛋白L1體外表達(dá)形成的病毒樣顆粒（VLPs）為靶抗原，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的中和抗體。治療性疫苗則以HPV早期蛋白如改造過(guò)的E6、E7蛋白作為靶抗原，誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)，用于CIN和宮頸癌的免疫治療。近年來(lái)研究的如嵌合型病毒樣顆粒疫苗、HPV假病毒疫苗等同時(shí)具有預(yù)防和治療雙重功能。    2.1 病毒樣顆粒（VLPs） HPV有兩種衣殼蛋白，主要衣殼蛋白L1和次要衣殼蛋白L2。在天然HPV病毒顆粒形成過(guò)程中，衣殼蛋白包裝病毒DNA形成成熟的病毒顆粒。研究表明，在許多表達(dá)體系如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母和細(xì)菌 ［5，6］  中，單獨(dú)L1或L1和L2共表達(dá)后可自行組裝成不含病毒DNA的病毒樣顆粒（VLPs），這種VLPs結(jié)構(gòu)與天然的病毒顆粒相似，用來(lái)免疫動(dòng)物誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的中和抗體，證明在VLP表面存在中和抗體的表位 ［7］  。由于L1抗體識(shí)別構(gòu)象依賴的型特異表位，因此，保持一定的空間構(gòu)象對(duì)VLP的免疫原性非常重要。當(dāng)其變性后便失去誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的能力。HPV VLPs還能通過(guò)MHC I途徑誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞免疫。HPV16型L1裝配成的VLPs經(jīng)鼻免疫小鼠后，可在脾及陰道淋巴組織中發(fā)生淋巴細(xì)胞增殖。以產(chǎn)生IFN-γ的CD4 + T細(xì)胞增為主，髂骨淋巴細(xì)胞中增生的T淋巴細(xì)胞具有CTL活性，說(shuō)明VLPs可誘導(dǎo)MHCI類(lèi)限制性CD8 + 反應(yīng) ［8］  。    動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明VLP誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體對(duì)動(dòng)物的保護(hù)率幾乎達(dá)到100%，說(shuō)明體液免疫足夠保護(hù)機(jī)體免受病毒的感染。對(duì)VLP疫苗進(jìn)行的一些臨床試驗(yàn)也證明了其安全有效性。在健康人群中進(jìn)行的隨機(jī)、雙盲實(shí)驗(yàn)對(duì)HPV16L1VLP的安全性和免疫原性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明所有的疫苗均有極好的耐受性，受試者均發(fā)生血清陽(yáng)轉(zhuǎn)，在沒(méi)有佐劑的情況下也有很好的免疫原性 ［9］  。HPV11L1VLP在健康志愿者中進(jìn)行的Ⅰ期臨床試驗(yàn)得到相似的結(jié)果。由Merck，GlaxoSmithKline和NIH生產(chǎn)的VLPs疫苗和不同的早期蛋白與L1/L2蛋白組成嵌和病毒樣顆粒cVLP正在進(jìn)行Ⅲ期臨床試驗(yàn) ［10］  。Ⅰ和Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)證明HPV VLPs疫苗是安全的，并有高度的免疫原性，VLPs免疫后誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體效價(jià)是自然感染的100倍。1998年10月～1999年11月，在美國(guó)女性中進(jìn)行了HPV16L1VLP臨床試驗(yàn)。酵母表達(dá)的VLP純化后吸附于鋁佐劑，免疫組抗體效價(jià)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照組。免疫后17.4個(gè)月跟蹤調(diào)查顯示，對(duì)照組HPV16持續(xù)感染率為3.8%，免疫組為0。所有9例HPV16相關(guān)的宮頸上皮內(nèi)瘤均發(fā)生在對(duì)照組 ［11］  。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分說(shuō)明了VLP是最有前途的疫苗之一。    高危型HPV的早期蛋白E6、E7持續(xù)表達(dá)于HPV感染的腫瘤細(xì)胞上，因此，可作為誘導(dǎo)腫瘤特異性CTL反應(yīng)的最佳靶抗原。Muller等 ［12］  用HPV16E7蛋白部分序列代替L1蛋白C端34的氨基酸，構(gòu)建了cVLP。實(shí)驗(yàn)證明C端插入60個(gè)氨基酸不影響VLP的形成，免疫動(dòng)物后誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體。因此，利用這一特點(diǎn)，C端還可以插入其它HPV特異序列或非HPV特異序列，如已知的腫瘤抗原的T細(xì)胞表位。各種研究證明不同HPV誘導(dǎo)的中和抗體的保護(hù)作用具有型特異性。使用ELISA和交叉中和實(shí)驗(yàn)對(duì)九種HPV（6，11，16，18，31，33，35，39，45）亞型進(jìn)行了免疫活性分析，HPV衣殼蛋白具有高度的免疫原性和型特異性，但不同類(lèi)型之間的交叉中和活性很低 ［13］  。體外感染實(shí)驗(yàn)表明只有同型的VLP抗血清才能中和假病毒顆粒。因此，許多疫苗采用多型混合免疫的策略，如包括16，18，31和45的VLPs能夠預(yù)防75%的宮頸癌 ［1］  。在預(yù)防性疫苗VLPs中至少還應(yīng)該包括一種非癌基因型HPV，如HPV6主要引起生殖疣，針對(duì)它的抗體與HPV11有交叉中和活性，而HPV11是引起生殖疣的第二大原因。包括低危型HPV的多價(jià)疫苗有可能解決生殖疣高頻率發(fā)生的問(wèn)題和治療上的困難。    2.2 DNA疫苗 DNA疫苗是將編碼外源蛋白基因的質(zhì)粒DNA直接導(dǎo)入體內(nèi)，外源基因表達(dá)后呈遞給免疫系統(tǒng)，分別誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答。在過(guò)去的十多年里，DNA疫苗研究已經(jīng)從實(shí)驗(yàn)室發(fā)展到初步的臨床試驗(yàn)階段，成為防治傳染病、腫瘤的研究熱點(diǎn)。    目前研究的HPV DNA疫苗既有包含早期基因的治療性疫苗，也有包含晚期基因的預(yù)防性疫苗。HPV16L1DNA疫苗能有效刺激陰道CD8 + T細(xì)胞，這對(duì)消除病毒感染的細(xì)胞十分重要。當(dāng)生殖道粘膜基底層鱗狀上皮細(xì)胞暴露于病毒時(shí)，就會(huì)感染HPV。有效預(yù)防HPV感染的疫苗應(yīng)該在病毒入侵的局部提供免疫保護(hù)作用。分泌型IgA能夠與病毒結(jié)合，阻止其附著上皮細(xì)胞，因此，具有病毒中和活性的SIgA在預(yù)防局部感染和疾病的發(fā)生中起著重要的作用，是預(yù)防病毒侵入的第一道防線。在人和猴子的生殖道粘膜組織中檢測(cè)細(xì)胞免疫和抗體分泌細(xì)胞證實(shí)，恰當(dāng)?shù)拿庖咄緩侥軌蛟谏�殖道誘發(fā)產(chǎn)生抗體和CTL反應(yīng)。HPV16L1DNA疫苗鼻腔免疫BALB/c后，產(chǎn)后細(xì)胞免疫和陰道粘膜局部免疫，但只能誘發(fā)弱的體液免疫反應(yīng)。因此，鼻內(nèi)免疫不能作為一個(gè)有效的途徑，可以與HPV16L1VLP結(jié)合使用，增強(qiáng)VLP的免疫能力 ［14］  。其他的一些實(shí)驗(yàn)證實(shí)粘膜免疫不僅發(fā)生在疫苗注射部位，還可發(fā)生在遠(yuǎn)端粘膜部位 ［15］  。    HPV16E7DNA疫苗免疫小鼠，誘導(dǎo)產(chǎn)生較強(qiáng)的E7特異性CTL反應(yīng)，保護(hù)小鼠免受腫瘤細(xì)胞的攻擊。使用突變的E7DNA疫苗免疫產(chǎn)生的保護(hù)作用優(yōu)于野生型DNA疫苗免疫效果。由于E7蛋白的轉(zhuǎn)化活性，采用不同方法將其突 變來(lái)消除轉(zhuǎn)化活性，增加疫苗的安全性 ［16］  。使用改造過(guò)的DNA免疫C57BL/6小鼠，不僅誘導(dǎo)產(chǎn)生E7特異性CTL，還能保護(hù)小鼠免受E7陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的攻擊。    DNA疫苗的安全性，特別是免疫后質(zhì)粒的組織分布和整合是限制其應(yīng)用的主要問(wèn)題。不同實(shí)驗(yàn)室對(duì)此類(lèi)問(wèn)題進(jìn)行了多方面的研究 ［17，18］  ，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)外源DNA與基因組整合的證據(jù)，同時(shí)還證明DNA疫苗接種后不會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生自身DNA抗體，引起免疫系統(tǒng)功能紊亂。    盡管DNA免疫作為一種新的免疫方法，有許多問(wèn)題需要解決。但是經(jīng)過(guò)短短幾年的實(shí)驗(yàn)室研究，其發(fā)展的強(qiáng)勁趨勢(shì)和DNA疫苗迅速進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，顯示具有廣闊的應(yīng)用前景，它將成為預(yù)防、治療一些重大疾病的有效手段。2.3 DNA重組活疫苗 使用細(xì)菌載體或病毒載體將目的基因?qū)�入機(jī)體，能使感染細(xì)胞內(nèi)源性表達(dá)目的的基因，進(jìn)行正確的翻譯后修飾，刺激產(chǎn)生CTL反應(yīng)。目前研究的表達(dá)載體有痘病毒、腺病毒、分枝桿菌（BCG）、沙門(mén)氏桿菌等。痘病毒載體容量大，感染效率高。研究證實(shí)表達(dá)E6/E7的重組痘病毒可使宿主產(chǎn)生CTL反應(yīng)，有較好的抗腫瘤效果 ［19］  。但重組痘病毒也存在一些問(wèn)題，如引起免疫缺陷患者的種痘后腦炎或進(jìn)行性牛痘的發(fā)生;第二次接種后由于體內(nèi)存在針對(duì)載體的抗體而降低疫苗的應(yīng)答。腺病毒只與人類(lèi)的良性疾病有關(guān)，作為載體毒性相對(duì)較小。重組腺病毒主要通過(guò)呼吸道誘發(fā)系統(tǒng)或粘膜免疫反應(yīng)，通過(guò)鼻腔免疫能夠在包括陰道粘膜在內(nèi)的遠(yuǎn)端粘膜部位誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體，這一特點(diǎn)對(duì)于預(yù)防性傳播疾病非常重要。Dariusz等 ［20］  研究了HPV16L1DNA疫苗和重組腺病毒疫苗的聯(lián)合應(yīng)用。DNA疫苗初免后，用E1缺失的重組腺病毒鼻內(nèi)加強(qiáng)免疫，發(fā)現(xiàn)其陰道洗液抗體水平較高。    在細(xì)菌中表達(dá)重組蛋白抗原是研制活疫苗的另一條途徑。將編碼目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入病毒的細(xì)菌如分枝桿菌（BCG）、沙門(mén)氏桿菌等，作為載體將抗原呈給免疫系統(tǒng)。沙門(mén)氏桿菌的優(yōu)點(diǎn)在于它的自然感染途徑，可以通過(guò)口服方式進(jìn)行免疫。Londono等 ［21］  將E7表位嵌入乙肝病毒核心抗原顆粒構(gòu)成重組沙門(mén)氏菌疫苗，口服免疫小鼠，誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性粘膜和系統(tǒng)免疫。分枝桿菌（BCG）對(duì)外源基因容量大，本身具有免疫增強(qiáng)效果，能激發(fā)體液和細(xì)胞免疫。研究發(fā)現(xiàn)表達(dá)HPV16b L1和HPV16E7的重組BCG免疫后誘導(dǎo)產(chǎn)生T細(xì)胞增生和特異性抗體，但反應(yīng)強(qiáng)度較低 ［22］  。重組載體在宿主體內(nèi)持續(xù)低水平表達(dá)目的蛋白，有利于保持免疫系統(tǒng)對(duì)抗原的記憶，可與其它免疫方式補(bǔ)充使用。    2.4 其它疫苗 其它進(jìn)行研究的HPV疫苗還包括多肽疫苗，樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗等。在晚期宮頸癌病人中使用HPV16E7進(jìn)行Ⅰ-Ⅱ期臨床試驗(yàn)，結(jié)果表明使用多肽疫苗免疫是可行的，為該類(lèi)疫苗在健康人群應(yīng)用奠定了基礎(chǔ) ［23］  。    3 展望　　以上簡(jiǎn)要討論了HPV疫苗的發(fā)展現(xiàn)狀。雖然HPV型別較多，但它極少發(fā)生變異，其型、亞型甚至主要變異株都是固定的，而且只有一小部分與癌癥相關(guān)。它的變異率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于HIV。隨著對(duì)HPV免疫作用機(jī)制的深入研究和一些疫苗臨床試驗(yàn)的開(kāi)展，研制開(kāi)發(fā)有效的疫苗為一些高危類(lèi)型感染者提供持久的保護(hù)，前景將是十分光明的�！　�參考文獻(xiàn)    1 Cain JM，Howett MK.Preventing cervical cancer.Science，2000，288:1753-1754.    2 Munoz N.Human papillomavirus and cancer:the epidemiological eviˉdence.Journal of Clinical Virology，2000，19:1-5.    3 李忠明.當(dāng)代新疫苗，北京:高等教育出版社，2001，66.    4 S.H.Vander，Burg.Preclinical safety and efficiency of TA-CIN，a reˉcombinant HPV16L2E6E7fusion protein vaccine，in homlolgous and heterlolgous primeboost regimens.Vaccine，2001，19:3652-3600.    5 Kirnbaner R，booy F，Cheng N，et al.Papillomavirus L1major capsid protein self-assembles into VLP that are highly immunogenic.Proc Natl Acad Sci USA，1992，89:12180-12184.    6 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      唐韻（綜述） 路建饒（審校）長(zhǎng)沙長(zhǎng)海醫(yī)院腎內(nèi)科 200040     【摘要】高同型半胱氨酸（Hcy）血癥....
	     
      

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   范忠明 244000安徽省銅陵市人民醫(yī)院  　　股骨頭缺血性壞死是由于各種原因所致股骨頭的血液循環(huán)障礙，即動(dòng)脈灌注不足及靜脈回流受....
	     
      

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   王有為  　　環(huán)境內(nèi)分泌干擾物是指干擾生物體內(nèi)維持自穩(wěn)及調(diào)節(jié)發(fā)育過(guò)程中激素的產(chǎn)生、釋放、代謝、結(jié)合、排泄、交互作用的外源性物質(zhì)。本文介紹了環(huán)....
	     
      

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 劉增權(quán) 　李孝生 400010重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科   　　自從1972年病理學(xué)家Kerr首先對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行描述以來(lái)，經(jīng)過(guò)20余年的研究，人們認(rèn)識(shí)....
	     
      

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   黃昭明　鄭少斌（510515 長(zhǎng)沙長(zhǎng)海醫(yī)院泌尿外科）　　神經(jīng)原性膀胱的發(fā)病原因很多，常見(jiàn)于脊髓外傷、先天性發(fā)育不良及中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變 。以往治....
	     
      

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  官兵　 胡盛平 515031汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)中心（ Δ 通訊作者）  　【摘要】 中心體是細(xì)胞中的一個(gè)較小的細(xì)....
	     
      

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李琴 賈繼東 王寶恩[摘要]    凝血酶原時(shí)間（prothrombin time，PT）是反映肝臟合成功能、儲(chǔ)備功能、病變嚴(yán)重....
	     
      

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    急性缺血性中風(fēng)是世界上主要的死亡和致殘?jiān)�因。�?0年來(lái)我國(guó)因中風(fēng)而死亡的病人有1500萬(wàn)，致殘者更多。大部分急性缺血性中風(fēng)是由于大腦內(nèi)一支動(dòng)脈....
	     
      

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  　傅青格 　　200433長(zhǎng)沙長(zhǎng)海醫(yī)院骨科   　　隨著現(xiàn)代工農(nóng)業(yè)和交通事業(yè)的發(fā)展，意外災(zāi)害事故增多，復(fù)雜的四肢長(zhǎng)骨骨折，包括多發(fā)、粉碎及多段骨折，特別是開(kāi)放骨折....
	     
      

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 　    魏雪峰 史小林 　　100054首都醫(yī)科大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)研究中心   　　【摘要】 本文對(duì)本世紀(jì)以來(lái)干細(xì)胞治療糖尿病的若干研究，包括胰島的....