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化學消毒劑作用機理研究進展
化學消毒劑作用機理研究進展 摘要: 細胞壁的屏障作用是微生物降低對消毒劑敏感性的普遍機制。消毒劑對細胞膜的作用導致膜的通透性增加, 胞內物質泄漏, 呼吸鏈被破壞等。一些消毒劑能直接改變、破壞蛋白質和核酸的結構和功能, 但核酸和蛋白質的合成過程可能比結構本身對消毒劑更加敏感。流式細胞儀、單細胞凝膠電泳等新技術的應用將使人們能夠更深刻地了解消毒劑的作用機理。
關鍵詞: 化學消毒劑, 作用機理, 細胞膜, 蛋白質, 核酸
近年來, 開發(fā)應用于消毒的化學物質單體及其復配制劑不斷增多。由于微生物對消毒劑抗藥性日益嚴重以及人們健康環(huán)保意識的不斷增強, 開發(fā)高效低毒的消毒劑產品是未來的發(fā)展趨勢, 因此, 須從機理上去闡明各種消毒劑對微生物的致死作用。國內外研究者從細胞壁、細胞膜、細胞質、核酸以及細胞的物質能量代謝等不同層面和角度進行消毒機理的研究, 取得了相當的進展。
1 消毒劑對微生物細胞壁的作用
細胞壁的屏障作用是微生物降低對藥物敏感性的普遍機制, 特別是分支桿菌、革蘭氏陰性細菌及芽孢。具體而言, 細菌細胞壁中的肽聚糖, 真菌的葡聚糖、甘露聚糖,芽孢外壁中的吡啶二羧酸, 分支桿菌中分枝酸的含量等都對消毒劑的吸收和透過具有重要影響, 甚至培養(yǎng)基的構成也會影響到微生物對消毒劑的敏感性[ 1 ] 。Fraud等人的研究表明, 分支桿菌的原生質體對鄰苯二甲醛、戊二醛及雙氯雙胍乙酸的敏感性均比非原生質體顯著增強, 可能是失去細胞壁后細胞表面的疏水性下降所致[ 2 ] 。Hiom等人發(fā)現釀酒酵母(Saccharom yces cerevisiae) 細胞壁的厚度、孔密度及葡聚糖含量影響其對雙氯雙胍己烷(Chlorhexidine, CHX) 的敏感性, 但與甘露聚糖的含量無關。隨著細胞壁的孔密度降低或厚度增大, 細胞對CHX的吸收量下降[ 3 ] 。通常認為消毒劑是以被動擴散的方式經過葡萄球菌的細胞壁, 對于其它革蘭氏陽性菌則所知甚少。革蘭氏陰性菌的細胞壁外層為脂多糖、磷脂和脂蛋白組成的外膜, 親水性和親脂性消毒劑分別由外膜上的親水性和親脂性孔道進入。陽離子消毒劑可通過對外膜的破壞而使自身的被動吸收量提高, 如雙胍類、季銨鹽類等。
細菌芽孢的外壁因富含吡啶二羧酸而難以被殺滅。研究發(fā)現枯草芽孢桿菌營養(yǎng)細胞對戊二醛的吸收量大于萌發(fā)中的芽孢, 而休眠的芽孢其吸收量最小。另外, 氯比碘更能有效殺死枯草芽孢桿菌的芽孢, 可能是因為該芽孢對氯的吸收比對碘的吸收快。雖然很少有消毒劑把真菌細胞壁作為主要的作用靶點, 但幾丁質是一個潛在的交聯劑(甲醛和戊二醛) 作用位點。
2 消毒劑對微生物細胞膜及胞內物質的作用
細胞膜在維持微生物的正常生命活動中具有非常重要的地位。對于細菌而言, 細胞膜不僅保持胞內物質與外界的隔離性, 而且是物質與能量代謝的場所。消毒劑對細胞膜作用的表現為膜的通透性增加, 胞內物質泄漏, 呼吸鏈被破壞, ATP的合成減少或停止, 糖酵解終止等。這些作用均可導致細菌的死亡。
2.1 對膜的作用 生物的細胞膜主要由磷脂雙分子層和蛋白質構成, 兩者都可以成為消毒劑分子作用的目標。雙胍類和季銨鹽類一般是以膜上的磷脂分子作為作用靶標而造成各種微生物細胞膜的損傷。多聚雙胍類使大腸桿菌( Escherichia coli) 的內膜產生脂相分離和產生酸性磷脂。過氧化氫產生的羥自由基能氧化酶和蛋白的巰基, 也常常攻擊細胞膜上的不飽和脂肪酸(當然還有其它作用) 。通常, 很多消毒劑都能與蛋白質和酶上的巰基發(fā)生作用, 使膜蛋白受到破壞。
K+泄漏是膜受到損傷的直接證據之一[ 4 ] 。K+非常迅速地從受損細胞中釋放出來,并且可以方便地用原子吸收分光光度計、K+選擇性電極、電感耦合等離子質譜儀等檢測, 已有多種消毒劑作用于微生物導致K+泄漏的報道。
原生質體裂解作用是確認消毒劑對細胞膜損傷作用的另一個好方法。相對“正�！奔毎�, 原生質體受到消毒劑攻擊時更容易裂解。不同消毒劑對同一種原生質體破壞程度不同, 同一種消毒劑對不同種原生質體的作用程度也有差異。Caroline 發(fā)現Polyquaternium - 1 ( PQ - 1, 一種季銨鹽類化合物) 能有限破壞粘質沙雷氏菌(Serratiam arcescens) 的細胞膜, 但不能裂解白色念珠菌(Candida albicans) 的原生質體, Myris-tamidop ropyl dimethylamine (MAPD, 一種氨基胺) 也只能導致白色念珠菌部分裂解; 但PQ - 1和MAPD都能殺滅白色念珠菌, 且都能導致K+泄漏。也許它們對膜的損傷只導致K+的泄漏而沒有達到使原生質體裂解的程度。但PQ - 1和MAPD都能很好地裂解粘質沙雷氏菌的原生質體。由此看來有些消毒劑對膜的損傷很有限[ 5 ] 。
此外, 測定ATP、磷酸鹽的泄漏, 以及細胞對某些物質的吸收速率也是證明膜受損的有效方法。但是, 對膜損傷的研究不應僅僅停留在測定胞內物質泄漏以及外膜裂解的層面上。特別是真核生物, 其內膜體系與生命的關鍵代謝戚戚相關, 研究消毒劑如何作用于真核生物的內膜系統, 將使我們能夠更深入地了解真核生物的消毒機理。
2.2 對代謝的影響 維持生命活動的重要代謝活動包括糖酵解、三羧酸循環(huán)、呼吸鏈(電子傳遞鏈) 、氧化磷酸化(ATP的生成) 、核酸和蛋白質的合成等。這幾個重要代謝活動中的任何一個被終止都可能導致生命活動的停止。物質能量代謝成為研究消毒機理更為深層次的問題。
膜的完整性受到破壞后, 其通透性增加, 胞內的物質會往外泄漏, 這其中包括代謝中間產物及催化有關反應的酶。Iwami[ 6 ]的研究顯示, 洗必泰作用后鏈球菌突變體NC IB11723的糖酵解速率下降, 但這種下降主要是由于酵解中間產物的泄漏引起的。
呼吸被抑制的重要標志是ATP合成量的減少。原核生物的呼吸鏈位于細胞膜上,消毒劑與膜的接觸可破壞呼吸鏈, 導致ATP合成下降或受阻, 造成細胞死亡。Dinning等[ 7 ]用蟲熒光素- 蟲熒光素酶生物發(fā)光法測定并發(fā)現亞抑制濃度的羥基吡啶硫酮就能使胞內ATP水平大幅度下降。劉雪林等發(fā)現二氧化氯作用30 s后大腸桿菌的ATP酶活性下降顯著。
W illiams[ 8 ]發(fā)現3 - 氯- 4, 4 - 二甲基- 2 - 惡唑烷酮和1, 3 - 二氯- 4, 4, 5, 5- 四甲基- 2 - 咪唑烷酮對金黃色葡萄球菌的K+泄漏和H+通透性增加作用不大, 但細胞的耗氧量減少, 可見抑制呼吸酶是這兩種抑菌劑作用的第一步, 并最終會導致微生物失活。
目前對呼吸抑制作用的證據主要是氧消耗(或吸收) 的減少或ATP合成水平下降等間接指標。但消毒劑具體作用在呼吸鏈上的哪一個環(huán)節(jié)或哪一種酶還難以確定, 也許是這些酶難以分離純化阻礙了這方面的研究。真核生物的呼吸鏈位于線粒體內膜上,其呼吸鏈與消毒劑接觸的難度比原核生物大, 因此消毒劑對它的能量代謝的作用機制可能更復雜些。
脂肪酸含量變化也被用來分析消毒劑的作用機理。Triclosan是一種膜作用劑, 但研究顯示其對于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌及其它細菌的生長抑制作用主要是因為依賴于NADH的脂酰- ACP轉移還原酶被抑制, 造成脂肪酸合成被停止。劉雪林發(fā)現大腸桿菌被二氧化氯殺滅與脂質被氧化有關。另外, 碘類消毒劑、過氧乙酸等也對細胞膜上的脂肪酸發(fā)生作用。
用同位素標記法研究消毒劑對蛋白質及核酸合成的影響也是一個重要的研究方法。Viktor[ 9 ]用14 C - Adenine和14 C - Leucine作為合成前體測定了16種季銨鹽類消毒劑對陰溝腸桿菌( Enterobacter cloacae) 的蛋白質及DNA合成的影響, 發(fā)現有15種消毒劑的DNA合成的IC50小于蛋白質合成的IC50 , 其中7種消毒劑主要作用于DNA的合成。似乎陰溝腸桿菌DNA合成比蛋白質合成更容易受季銨鹽類消毒劑的影響。也有人用同位素摻入法研究了二氧化氯對蛋白質合成的影響。
病毒的外殼蛋白( cap sid p rotein) 一直是研究病毒消殺機理的一個熱點。消毒劑與病毒外殼的作用方式與強度因消毒劑和病毒的種類而異�？傮w而言, 有包膜病毒比裸病毒對消毒劑更敏感。多數化學消毒劑對有包膜病毒幾乎都有效, 但季銨鹽類、洗必泰、戊二醛對裸病毒的殺滅效果都不甚理想。有研究顯示, 病毒基因組不是戊二醛作用的理想位點, 戊二醛主要與病毒外殼上的氨基酸發(fā)生交聯作用, 特別是與賴氨酸上的ε-氨基發(fā)生交聯。Martine[ 101證明了戊二醛對腸病毒的毒力與病毒VP1外殼蛋白上的賴氨酸殘基的排列順序有關, 而與其總數目沒有明顯相關性。
3 消毒劑對核酸的作用
核酸位于細胞的內部, 真核生物的核酸還有核膜包被, 因此核酸可能是消毒劑最后到達的位點之一。芬頓反應( Fenton reaction) 是一個能產生羥自由基的反應體系( Fe2 + +H2O2 → Fe3 + +OH- + ·OH ) , 常被應用于羥自由基對DNA損傷的胞外研究。胞外的DNA損傷試驗為研究胞內的DNA損傷提供了有益的信息[ 11 ] 。質粒pSV2neo在芬頓反應處理后, 透射電鏡顯示其損傷包括形成缺口環(huán)狀分子、線狀分子、單鏈嚕噗( loop) 結構和質粒聚合物等[ 12 ] 。戊二醛似乎對枯草芽孢桿菌芽孢的DNA沒有損傷作用。陳春田發(fā)現二氧化氯可導致大腸桿菌DNA漏出, 但漏出率與殺滅率不成比例。
含氯消毒劑對細菌DNA毒性包括形成含氯的核苷酸堿基衍生物, 216mg/L的次氯酸作用5min能徹底抑制大腸桿菌的生長, 對DNA合成的抑制率為96% , 而對蛋白質合成的抑制率僅為10%~50% , 因此推斷DNA合成是對該消毒劑的更為敏感的環(huán)節(jié)。含氯消毒劑具有殺病毒活性, Olivieri發(fā)現氯( chlorine) 對f2噬菌體裸露RNA及完整衣殼內的RNA有同等的損傷效果, 但其外殼蛋白仍然能夠進入宿主; Taylor和Butler發(fā)現1型脊髓灰質炎病毒( Poliovirus type 1) 的RNA在病毒外殼形態(tài)發(fā)生明顯改變之前即被降解成RNA片段; 但Floyed和OpBrien證實脊髓灰質炎病毒的衣殼也能被嚴重損壞。此種矛盾結果尚需進一步研究澄清。
基因組核酸不是戊二醛作用的理想靶點。對噬菌體F116的研究發(fā)現, 經戊二醛預處理后的噬菌體顆粒仍有感染銅綠假單胞菌的能力。在病毒SV40中, 只有戊二醛、甲醛等能引發(fā)蛋白質- DNA交聯的醛類, 才能抑制DNA的合成。
辛忠濤等[ 13 ]研究氯及二氧化氯對甲肝病毒(HAV) 的滅活作用表明, 病毒在抗原被破壞前已失活, 推測可能是核酸遭到了損傷。李君文等[ 14 ] 用RT2PCR 步移法及EL ISA法證實了前者的推測: 在氯或二氧化氯的作用下, HAV病毒的感染性喪失與5’端非編碼區(qū)約600bp的RNA片段被破壞有關。
4 展望
由于消毒劑公認的多靶點作用性, 也由于微生物是一個構成復雜的龐大群體, 其細胞組成千差萬別, 個體極其微小, 要確切了解消毒劑對它們的作用機理, 其難度不小。只有聯合運用生物、化學及物理的方法才能獲得比較滿意的結果。比如, 消毒劑對核酸的作用總體來說研究得還不夠深入。特別是在細菌和真菌的研究方面, 很多研究者還僅僅停留在通過消殺液OD260的變化來推測核酸是否受損。實際上即使核酸受損也不一定釋放到胞外; 也未見有從OD260增高的消殺液中提取到核酸的報道。更深入、細致的研究必須不斷地采用新的設備、方法和技術。近二十年來細胞學研究方面的一些新技術, 如流式細胞儀( Flow cytometry) , 單細胞凝膠電泳( Single-cell gel electro-phoresis) 等, 使得人們可以在單細胞水平上探測細胞的死活、膜受損、核酸含量變化以及DNA的斷裂、損傷等, 彌補了以往群體水平研究的不足[ 15, 16 ] 。已有人嘗試將這些技術用于抗菌肽作用機理的研究, 相信在化學消毒機理方面亦可借鑒。
目前的消毒機理主要是以病毒和細菌為材料, 關于真核微生物的研究則鮮有報道。但真核微生物是重要的病原菌之一, 鑒于其細胞結構不同于病毒和細菌, 對其進行專門的消毒機理研究具有理論和實踐意義。
總之, 人們應從微生物的細胞膜、細胞壁、細胞器、蛋白質、核酸以及細胞的物質能量代謝等方面進行多層面的研究, 力爭闡明特定消毒劑在某種(類) 微生物上的首要靶點, 對于可以致DNA 損傷的消毒劑, 則應闡明這種損傷在致死中的作用。另外, 弄清消毒劑在低濃度和高濃度下作用機理的異同也很重要。
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