|
化學(xué)消毒劑作用機(jī)理研究進(jìn)展
化學(xué)消毒劑作用機(jī)理研究進(jìn)展 摘要: 細(xì)胞壁的屏障作用是微生物降低對(duì)消毒劑敏感性的普遍機(jī)制。消毒劑對(duì)細(xì)胞膜的作用導(dǎo)致膜的通透性增加, 胞內(nèi)物質(zhì)泄漏, 呼吸鏈被破壞等。一些消毒劑能直接改變、破壞蛋白質(zhì)和核酸的結(jié)構(gòu)和功能, 但核酸和蛋白質(zhì)的合成過(guò)程可能比結(jié)構(gòu)本身對(duì)消毒劑更加敏感。流式細(xì)胞儀、單細(xì)胞凝膠電泳等新技術(shù)的應(yīng)用將使人們能夠更深刻地了解消毒劑的作用機(jī)理。
關(guān)鍵詞: 化學(xué)消毒劑, 作用機(jī)理, 細(xì)胞膜, 蛋白質(zhì), 核酸
近年來(lái), 開(kāi)發(fā)應(yīng)用于消毒的化學(xué)物質(zhì)單體及其復(fù)配制劑不斷增多。由于微生物對(duì)消毒劑抗藥性日益嚴(yán)重以及人們健康環(huán)保意識(shí)的不斷增強(qiáng), 開(kāi)發(fā)高效低毒的消毒劑產(chǎn)品是未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì), 因此, 須從機(jī)理上去闡明各種消毒劑對(duì)微生物的致死作用。國(guó)內(nèi)外研究者從細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、核酸以及細(xì)胞的物質(zhì)能量代謝等不同層面和角度進(jìn)行消毒機(jī)理的研究, 取得了相當(dāng)?shù)倪M(jìn)展。
1 消毒劑對(duì)微生物細(xì)胞壁的作用
細(xì)胞壁的屏障作用是微生物降低對(duì)藥物敏感性的普遍機(jī)制, 特別是分支桿菌、革蘭氏陰性細(xì)菌及芽孢。具體而言, 細(xì)菌細(xì)胞壁中的肽聚糖, 真菌的葡聚糖、甘露聚糖,芽孢外壁中的吡啶二羧酸, 分支桿菌中分枝酸的含量等都對(duì)消毒劑的吸收和透過(guò)具有重要影響, 甚至培養(yǎng)基的構(gòu)成也會(huì)影響到微生物對(duì)消毒劑的敏感性[ 1 ] 。Fraud等人的研究表明, 分支桿菌的原生質(zhì)體對(duì)鄰苯二甲醛、戊二醛及雙氯雙胍乙酸的敏感性均比非原生質(zhì)體顯著增強(qiáng), 可能是失去細(xì)胞壁后細(xì)胞表面的疏水性下降所致[ 2 ] 。Hiom等人發(fā)現(xiàn)釀酒酵母(Saccharom yces cerevisiae) 細(xì)胞壁的厚度、孔密度及葡聚糖含量影響其對(duì)雙氯雙胍己烷(Chlorhexidine, CHX) 的敏感性, 但與甘露聚糖的含量無(wú)關(guān)。隨著細(xì)胞壁的孔密度降低或厚度增大, 細(xì)胞對(duì)CHX的吸收量下降[ 3 ] 。通常認(rèn)為消毒劑是以被動(dòng)擴(kuò)散的方式經(jīng)過(guò)葡萄球菌的細(xì)胞壁, 對(duì)于其它革蘭氏陽(yáng)性菌則所知甚少。革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁外層為脂多糖、磷脂和脂蛋白組成的外膜, 親水性和親脂性消毒劑分別由外膜上的親水性和親脂性孔道進(jìn)入。陽(yáng)離子消毒劑可通過(guò)對(duì)外膜的破壞而使自身的被動(dòng)吸收量提高, 如雙胍類、季銨鹽類等。
細(xì)菌芽孢的外壁因富含吡啶二羧酸而難以被殺滅。研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞對(duì)戊二醛的吸收量大于萌發(fā)中的芽孢, 而休眠的芽孢其吸收量最小。另外, 氯比碘更能有效殺死枯草芽孢桿菌的芽孢, 可能是因?yàn)樵撗挎邔?duì)氯的吸收比對(duì)碘的吸收快。雖然很少有消毒劑把真菌細(xì)胞壁作為主要的作用靶點(diǎn), 但幾丁質(zhì)是一個(gè)潛在的交聯(lián)劑(甲醛和戊二醛) 作用位點(diǎn)。
2 消毒劑對(duì)微生物細(xì)胞膜及胞內(nèi)物質(zhì)的作用
細(xì)胞膜在維持微生物的正常生命活動(dòng)中具有非常重要的地位。對(duì)于細(xì)菌而言, 細(xì)胞膜不僅保持胞內(nèi)物質(zhì)與外界的隔離性, 而且是物質(zhì)與能量代謝的場(chǎng)所。消毒劑對(duì)細(xì)胞膜作用的表現(xiàn)為膜的通透性增加, 胞內(nèi)物質(zhì)泄漏, 呼吸鏈被破壞, ATP的合成減少或停止, 糖酵解終止等。這些作用均可導(dǎo)致細(xì)菌的死亡。
2.1 對(duì)膜的作用 生物的細(xì)胞膜主要由磷脂雙分子層和蛋白質(zhì)構(gòu)成, 兩者都可以成為消毒劑分子作用的目標(biāo)。雙胍類和季銨鹽類一般是以膜上的磷脂分子作為作用靶標(biāo)而造成各種微生物細(xì)胞膜的損傷。多聚雙胍類使大腸桿菌( Escherichia coli) 的內(nèi)膜產(chǎn)生脂相分離和產(chǎn)生酸性磷脂。過(guò)氧化氫產(chǎn)生的羥自由基能氧化酶和蛋白的巰基, 也常常攻擊細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸(當(dāng)然還有其它作用) 。通常, 很多消毒劑都能與蛋白質(zhì)和酶上的巰基發(fā)生作用, 使膜蛋白受到破壞。
K+泄漏是膜受到損傷的直接證據(jù)之一[ 4 ] 。K+非常迅速地從受損細(xì)胞中釋放出來(lái),并且可以方便地用原子吸收分光光度計(jì)、K+選擇性電極、電感耦合等離子質(zhì)譜儀等檢測(cè), 已有多種消毒劑作用于微生物導(dǎo)致K+泄漏的報(bào)道。
原生質(zhì)體裂解作用是確認(rèn)消毒劑對(duì)細(xì)胞膜損傷作用的另一個(gè)好方法。相對(duì)“正常”細(xì)胞, 原生質(zhì)體受到消毒劑攻擊時(shí)更容易裂解。不同消毒劑對(duì)同一種原生質(zhì)體破壞程度不同, 同一種消毒劑對(duì)不同種原生質(zhì)體的作用程度也有差異。Caroline 發(fā)現(xiàn)Polyquaternium - 1 ( PQ - 1, 一種季銨鹽類化合物) 能有限破壞粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiam arcescens) 的細(xì)胞膜, 但不能裂解白色念珠菌(Candida albicans) 的原生質(zhì)體, Myris-tamidop ropyl dimethylamine (MAPD, 一種氨基胺) 也只能導(dǎo)致白色念珠菌部分裂解; 但PQ - 1和MAPD都能殺滅白色念珠菌, 且都能導(dǎo)致K+泄漏。也許它們對(duì)膜的損傷只導(dǎo)致K+的泄漏而沒(méi)有達(dá)到使原生質(zhì)體裂解的程度。但PQ - 1和MAPD都能很好地裂解粘質(zhì)沙雷氏菌的原生質(zhì)體。由此看來(lái)有些消毒劑對(duì)膜的損傷很有限[ 5 ] 。
此外, 測(cè)定ATP、磷酸鹽的泄漏, 以及細(xì)胞對(duì)某些物質(zhì)的吸收速率也是證明膜受損的有效方法。但是, 對(duì)膜損傷的研究不應(yīng)僅僅停留在測(cè)定胞內(nèi)物質(zhì)泄漏以及外膜裂解的層面上。特別是真核生物, 其內(nèi)膜體系與生命的關(guān)鍵代謝戚戚相關(guān), 研究消毒劑如何作用于真核生物的內(nèi)膜系統(tǒng), 將使我們能夠更深入地了解真核生物的消毒機(jī)理。
2.2 對(duì)代謝的影響 維持生命活動(dòng)的重要代謝活動(dòng)包括糖酵解、三羧酸循環(huán)、呼吸鏈(電子傳遞鏈) 、氧化磷酸化(ATP的生成) 、核酸和蛋白質(zhì)的合成等。這幾個(gè)重要代謝活動(dòng)中的任何一個(gè)被終止都可能導(dǎo)致生命活動(dòng)的停止。物質(zhì)能量代謝成為研究消毒機(jī)理更為深層次的問(wèn)題。
膜的完整性受到破壞后, 其通透性增加, 胞內(nèi)的物質(zhì)會(huì)往外泄漏, 這其中包括代謝中間產(chǎn)物及催化有關(guān)反應(yīng)的酶。Iwami[ 6 ]的研究顯示, 洗必泰作用后鏈球菌突變體NC IB11723的糖酵解速率下降, 但這種下降主要是由于酵解中間產(chǎn)物的泄漏引起的。
呼吸被抑制的重要標(biāo)志是ATP合成量的減少。原核生物的呼吸鏈位于細(xì)胞膜上,消毒劑與膜的接觸可破壞呼吸鏈, 導(dǎo)致ATP合成下降或受阻, 造成細(xì)胞死亡。Dinning等[ 7 ]用蟲(chóng)熒光素- 蟲(chóng)熒光素酶生物發(fā)光法測(cè)定并發(fā)現(xiàn)亞抑制濃度的羥基吡啶硫酮就能使胞內(nèi)ATP水平大幅度下降。劉雪林等發(fā)現(xiàn)二氧化氯作用30 s后大腸桿菌的ATP酶活性下降顯著。
W illiams[ 8 ]發(fā)現(xiàn)3 - 氯- 4, 4 - 二甲基- 2 - 惡唑烷酮和1, 3 - 二氯- 4, 4, 5, 5- 四甲基- 2 - 咪唑烷酮對(duì)金黃色葡萄球菌的K+泄漏和H+通透性增加作用不大, 但細(xì)胞的耗氧量減少, 可見(jiàn)抑制呼吸酶是這兩種抑菌劑作用的第一步, 并最終會(huì)導(dǎo)致微生物失活。
目前對(duì)呼吸抑制作用的證據(jù)主要是氧消耗(或吸收) 的減少或ATP合成水平下降等間接指標(biāo)。但消毒劑具體作用在呼吸鏈上的哪一個(gè)環(huán)節(jié)或哪一種酶還難以確定, 也許是這些酶難以分離純化阻礙了這方面的研究。真核生物的呼吸鏈位于線粒體內(nèi)膜上,其呼吸鏈與消毒劑接觸的難度比原核生物大, 因此消毒劑對(duì)它的能量代謝的作用機(jī)制可能更復(fù)雜些。
脂肪酸含量變化也被用來(lái)分析消毒劑的作用機(jī)理。Triclosan是一種膜作用劑, 但研究顯示其對(duì)于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌及其它細(xì)菌的生長(zhǎng)抑制作用主要是因?yàn)橐蕾囉贜ADH的脂酰- ACP轉(zhuǎn)移還原酶被抑制, 造成脂肪酸合成被停止。劉雪林發(fā)現(xiàn)大腸桿菌被二氧化氯殺滅與脂質(zhì)被氧化有關(guān)。另外, 碘類消毒劑、過(guò)氧乙酸等也對(duì)細(xì)胞膜上的脂肪酸發(fā)生作用。
用同位素標(biāo)記法研究消毒劑對(duì)蛋白質(zhì)及核酸合成的影響也是一個(gè)重要的研究方法。Viktor[ 9 ]用14 C - Adenine和14 C - Leucine作為合成前體測(cè)定了16種季銨鹽類消毒劑對(duì)陰溝腸桿菌( Enterobacter cloacae) 的蛋白質(zhì)及DNA合成的影響, 發(fā)現(xiàn)有15種消毒劑的DNA合成的IC50小于蛋白質(zhì)合成的IC50 , 其中7種消毒劑主要作用于DNA的合成。似乎陰溝腸桿菌DNA合成比蛋白質(zhì)合成更容易受季銨鹽類消毒劑的影響。也有人用同位素?fù)饺敕ㄑ芯苛硕趸葘?duì)蛋白質(zhì)合成的影響。
病毒的外殼蛋白( cap sid p rotein) 一直是研究病毒消殺機(jī)理的一個(gè)熱點(diǎn)。消毒劑與病毒外殼的作用方式與強(qiáng)度因消毒劑和病毒的種類而異�？傮w而言, 有包膜病毒比裸病毒對(duì)消毒劑更敏感。多數(shù)化學(xué)消毒劑對(duì)有包膜病毒幾乎都有效, 但季銨鹽類、洗必泰、戊二醛對(duì)裸病毒的殺滅效果都不甚理想。有研究顯示, 病毒基因組不是戊二醛作用的理想位點(diǎn), 戊二醛主要與病毒外殼上的氨基酸發(fā)生交聯(lián)作用, 特別是與賴氨酸上的ε-氨基發(fā)生交聯(lián)。Martine[ 101證明了戊二醛對(duì)腸病毒的毒力與病毒VP1外殼蛋白上的賴氨酸殘基的排列順序有關(guān), 而與其總數(shù)目沒(méi)有明顯相關(guān)性。
3 消毒劑對(duì)核酸的作用
核酸位于細(xì)胞的內(nèi)部, 真核生物的核酸還有核膜包被, 因此核酸可能是消毒劑最后到達(dá)的位點(diǎn)之一。芬頓反應(yīng)( Fenton reaction) 是一個(gè)能產(chǎn)生羥自由基的反應(yīng)體系( Fe2 + +H2O2 → Fe3 + +OH- + ·OH ) , 常被應(yīng)用于羥自由基對(duì)DNA損傷的胞外研究。胞外的DNA損傷試驗(yàn)為研究胞內(nèi)的DNA損傷提供了有益的信息[ 11 ] 。質(zhì)粒pSV2neo在芬頓反應(yīng)處理后, 透射電鏡顯示其損傷包括形成缺口環(huán)狀分子、線狀分子、單鏈嚕噗( loop) 結(jié)構(gòu)和質(zhì)粒聚合物等[ 12 ] 。戊二醛似乎對(duì)枯草芽孢桿菌芽孢的DNA沒(méi)有損傷作用。陳春田發(fā)現(xiàn)二氧化氯可導(dǎo)致大腸桿菌DNA漏出, 但漏出率與殺滅率不成比例。
含氯消毒劑對(duì)細(xì)菌DNA毒性包括形成含氯的核苷酸堿基衍生物, 216mg/L的次氯酸作用5min能徹底抑制大腸桿菌的生長(zhǎng), 對(duì)DNA合成的抑制率為96% , 而對(duì)蛋白質(zhì)合成的抑制率僅為10%~50% , 因此推斷DNA合成是對(duì)該消毒劑的更為敏感的環(huán)節(jié)。含氯消毒劑具有殺病毒活性, Olivieri發(fā)現(xiàn)氯( chlorine) 對(duì)f2噬菌體裸露RNA及完整衣殼內(nèi)的RNA有同等的損傷效果, 但其外殼蛋白仍然能夠進(jìn)入宿主; Taylor和Butler發(fā)現(xiàn)1型脊髓灰質(zhì)炎病毒( Poliovirus type 1) 的RNA在病毒外殼形態(tài)發(fā)生明顯改變之前即被降解成RNA片段; 但Floyed和OpBrien證實(shí)脊髓灰質(zhì)炎病毒的衣殼也能被嚴(yán)重?fù)p壞。此種矛盾結(jié)果尚需進(jìn)一步研究澄清。
基因組核酸不是戊二醛作用的理想靶點(diǎn)。對(duì)噬菌體F116的研究發(fā)現(xiàn), 經(jīng)戊二醛預(yù)處理后的噬菌體顆粒仍有感染銅綠假單胞菌的能力。在病毒SV40中, 只有戊二醛、甲醛等能引發(fā)蛋白質(zhì)- DNA交聯(lián)的醛類, 才能抑制DNA的合成。
辛忠濤等[ 13 ]研究氯及二氧化氯對(duì)甲肝病毒(HAV) 的滅活作用表明, 病毒在抗原被破壞前已失活, 推測(cè)可能是核酸遭到了損傷。李君文等[ 14 ] 用RT2PCR 步移法及EL ISA法證實(shí)了前者的推測(cè): 在氯或二氧化氯的作用下, HAV病毒的感染性喪失與5’端非編碼區(qū)約600bp的RNA片段被破壞有關(guān)。
4 展望
由于消毒劑公認(rèn)的多靶點(diǎn)作用性, 也由于微生物是一個(gè)構(gòu)成復(fù)雜的龐大群體, 其細(xì)胞組成千差萬(wàn)別, 個(gè)體極其微小, 要確切了解消毒劑對(duì)它們的作用機(jī)理, 其難度不小。只有聯(lián)合運(yùn)用生物、化學(xué)及物理的方法才能獲得比較滿意的結(jié)果。比如, 消毒劑對(duì)核酸的作用總體來(lái)說(shuō)研究得還不夠深入。特別是在細(xì)菌和真菌的研究方面, 很多研究者還僅僅停留在通過(guò)消殺液OD260的變化來(lái)推測(cè)核酸是否受損。實(shí)際上即使核酸受損也不一定釋放到胞外; 也未見(jiàn)有從OD260增高的消殺液中提取到核酸的報(bào)道。更深入、細(xì)致的研究必須不斷地采用新的設(shè)備、方法和技術(shù)。近二十年來(lái)細(xì)胞學(xué)研究方面的一些新技術(shù), 如流式細(xì)胞儀( Flow cytometry) , 單細(xì)胞凝膠電泳( Single-cell gel electro-phoresis) 等, 使得人們可以在單細(xì)胞水平上探測(cè)細(xì)胞的死活、膜受損、核酸含量變化以及DNA的斷裂、損傷等, 彌補(bǔ)了以往群體水平研究的不足[ 15, 16 ] 。已有人嘗試將這些技術(shù)用于抗菌肽作用機(jī)理的研究, 相信在化學(xué)消毒機(jī)理方面亦可借鑒。
目前的消毒機(jī)理主要是以病毒和細(xì)菌為材料, 關(guān)于真核微生物的研究則鮮有報(bào)道。但真核微生物是重要的病原菌之一, 鑒于其細(xì)胞結(jié)構(gòu)不同于病毒和細(xì)菌, 對(duì)其進(jìn)行專門(mén)的消毒機(jī)理研究具有理論和實(shí)踐意義。
總之, 人們應(yīng)從微生物的細(xì)胞膜、細(xì)胞壁、細(xì)胞器、蛋白質(zhì)、核酸以及細(xì)胞的物質(zhì)能量代謝等方面進(jìn)行多層面的研究, 力爭(zhēng)闡明特定消毒劑在某種(類) 微生物上的首要靶點(diǎn), 對(duì)于可以致DNA 損傷的消毒劑, 則應(yīng)闡明這種損傷在致死中的作用。另外, 弄清消毒劑在低濃度和高濃度下作用機(jī)理的異同也很重要。
參考文獻(xiàn)
[ 1 ] Corinne L D, Jean P D, AntoineM, et al1 App l EnvironMicrobiol, 2002, 68: 1025~1032.
[ 2 ] Fraud S, Hann A, Maillard J, et al. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2003, 51: 575~584.
[ 3 ] Hiom S J, Furr J R, Russell A D, et al. Cytobios, 1996, 86 (345) : 123~135.
[ 4 ] Yoshiro I, Akiko S, Toshiko H, et al.. FEMSMicrobiology Letters, 2004, 237: 325~331.
[ 5 ] Caroline E C, Jean-YvesM, Russell A D. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2003, 51: 1153~1158.
[ 6 ] Iwami Y, Schachtele C F, Yamada T. OralMicrobiol Immunol, 1995, 10 (6) : 360~364.
[ 7 ] Dinning A A, Eastwood, Austin C. J App lMicrobiol, 1998, 85: 141 .
[ 8 ] WilliamsD E, Swango L J, Wilt G R, et al1 App1 EnvironMicrobiol, 1991, 57 (4) : 1121~1127.
[ 9 ] ViktorM, LubicaM. International Journal of Antimicrobial Agents. 1999, 11: 59~64.
[ 10 ] Martine C, Christine A, Jean-Luc B, et al1 App l EnvironMicrobiol, 2004, 70: 1717~1722.
[ 11 ] Shap iroM P, Setlow B, Setlow P. App lied and EnvironmentalMicrobiology, 2004, 70 (4) : 2535~2539.
[ 12 ] Chaudhuri S, Bhattacharyya N P, Bhattacharjee S B.Journal of ElectronMicroscopy, 1992, 41 (1) : 57~59.
[ 13 ] 辛忠濤, 李君文, 王新為, 等.衛(wèi)生研究, 2002, 31 (1) : 15~17.
[ 14 ] 李君文, 辛忠濤, 王新為, 等1中國(guó)消毒學(xué)雜志, 2003, 20 (1) : 1~51
[ 15 ] Park Y, Hahm J S, Hahm K S1 Protein Pep t Lett, 2006, 13 (1) : 53~581
[ 16 ] ArabskiM, Klup inska G, Chojnacki, J, et al1Mutat Res, 2005, 570 (1) : 129~1351
|